感受态细胞和质粒DNA的转化(C).ppt

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1、感受态细胞和质粒DNA的转化导入大肠杆菌:氯化钙转化法electroporation电击法又叫电穿孔法体外包装感染法重组DNA导入哺乳动物细胞:DNA-磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖转染法脂质体介导法、原生质体融合法酵母菌转化法:完整细胞转化法原生质体转化法电击法大肠杆菌(Escherichiacoli)大肠杆菌(Escherichiacoli)大约含3000kb的环状染色体DNA的棒状细菌。革兰氏阴性、兼性厌氧。最适生长温度37℃，PH7.0～7.6(一般7.4)，保存加甘油，培养皿密封。大肠杆菌的生长曲线可分为迟缓期(生长滞后期)、对数生长期(20~30min)、稳定期(饱和

2、期)，约1×109~2×108/mL和衰老期。大肠杆菌的不同菌株的保存期差别较大。有些菌株在液体培养基中，4℃可保存几个月，而有些菌株在相同条件下只能保存几天。如在相同条件下，大肠杆菌K12株比大肠杆菌X1776株保存期长。所以菌株首先应划平板分离单个菌落，经扩增后再做抗药性等鉴定，然后应用或保存。保存一般用对数生长后期的细菌。根据不同需要做短期、中期或长期保存。2.菌株的保存①LB琼脂平板划线，37℃，倒置平板培养(16-24hr)，形成单一菌落后，用石腊纸(parafilm)将平皿四周封严(使平皿隔绝空气)，倒置放入4℃或-20℃冰箱中，可保存数周。E.coli菌株的生存期差

3、别大：有些菌株在液体培养基中，4℃能存活几个月。有些菌株只能活几天。②穿刺琼脂(stabagar)，室温，避光可保存数年。③冰冻：单一菌落，液体培养基中扩增后，稀释后倒入10-50%甘油培养基中，分装，置-20～-70℃。可经过30次冻融，细菌仍然存活。菌LB中过液培养，加入等体积2×冰冻培养基。液氮速冻后置-70℃，可经15次冻融，保存5年以上。具体保存方法：琼脂穿刺培养基2×冰冻培养基琼脂（Difco）6gK2HPO412.6g细菌胰蛋白胨（Difco）10gN++-柠檬酸0.19gNaCl8gMgSO4＞H2O0.18gHCl20mg(NH4)2SO41.8gddH2O至1

4、LKH2PO43.6g甘油88gdH2O至1L菌株保存液的配制高压灭菌Phagemid-20℃Enzyme-20℃Buffers-20℃Primer-4℃Thiodeyivatives-20℃Ribonucleotides-20℃Helperphage-4℃置于—20℃或—80℃，并一个月检查一次抗生素工作浓度松驰型质粒严紧型质粒氨苄青霉素(Amp)50mg/mL（水）60ug/mL20ug/mL氯霉素(Cm)34mg/mL（乙醇）170ug/mL25ug/mL卡那霉素(Kan)50ug/mL（水）50ug/mL10ug/mL链霉素(Sm)10mg/mL（水）50ug/mL10u

5、g/mL四环素(Tc)5mg/mL（乙醇）50ug/mL10ug/mL抗生素的配制大肠杆菌感受态细胞制备和贮存在基因工程研究过程中，常常需要将外源DNA与载体DNA连接，重组后，导入大肠杆菌受体细胞中，进行DNA复制，扩增或表达，噬菌体单链或双链DNA导入大肠杆菌宿主菌中复制扩增。但很久以前人们就试图将DNA转化大肠杆菌但都没有成功。因此长期以来人们一直认为大肠杆菌缺乏天然的转化机理。1970年M.Mandela和A.Higa提出，在转化DNA之前，预先用氯化钙溶液处理大肠杆菌，能够人为地诱导这些大肠杆菌细胞呈现感受态，这种细胞称为感受态细胞。从而提高重组DNA转化入大肠杆菌的转

6、化频率。目前对这种机制尚不清楚。感受态细胞(Compenentcells)：将质粒DNA或重组质粒DNA转化到宿主菌中之前，必须使细菌呈感受状，即有能力摄取DNA的状态。(主要介绍用氯化钙溶液处理大肠杆菌制备感受态细胞的方法)①取出大肠杆菌HB101菌种管划LB琼脂平板，-70℃保存，37℃过夜(一般16小时)。②取一个菌落接种于3~5mlLB培养管中，37℃振培养，过夜(8~16小时)。③取出1mL过液菌加入新鲜配制的LB培养液50mL中(2%接种量)。37℃振荡培养，2~4小时。测定光密度值(约5×107个细胞/mL)，OD550达0.3~0.5。注意：不同的大肠杆菌菌株，每

7、mL培养物中细菌存活数与光密度值间关系不同。HB101，OD600=0.5（约×107个细胞/mL）X1776，OD600=0.2（约×107个细胞/mL）④细菌培养管取出置水浴中，10~15分钟。⑤细菌移入预冷的离心管中，4℃4000GSA转头，转离心5分钟；弃上清，留沉淀置于冰浴中。⑥加0.1mol/LCaCl2(预冷)溶液25mL，将沉淀充分悬浮，置冰浴中20~30分钟。延长CaCl2处理时间，可增加感受态，所以也可在0℃过夜。⑦4℃，4000~2500rpm转离心5分钟，