大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化.ppt

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1、大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化实验目的实验原理实验试剂实验步骤注意事项了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。一、实验目的二、实验原理感受态细胞(Competentcells)受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competentcell)。转化（transformation）是

2、将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。转化的方法：化学方法(热击法)：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞；电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细

3、胞。CaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl2法使用更广泛。克隆的筛选：主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等。重组DNA转化细菌过程示意图三、实验试剂材料大肠杆菌E.coliDH5α、pBS质粒、1.5ml离心管（又称eppendorf管）试剂LB培养基、0.1mol/LCaCl2、无菌水、氨苄青

4、霉素（Amp）四、实验步骤大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)①从E.coliDH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将该菌悬液以1:30～100接种于LB液体培养基中，37℃250r/min活化培养2-3h至OD600=0.2-0.4时停止培养;②每人取1个离心管，加入1.5ml菌液，在冰上放置10min后，于4℃，4000r／min离心2min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；③彻底弃去上清液，再加入0.6mL冰冷的0.1mo1／L

5、CaCl2溶液缓和悬菌，冰浴10min；④4000r／min离心10min；⑤弃去上清液，加入0.2mL冰冷的0.1mo1/LCaCl2溶液缓和悬菌，冰上放置待用。质粒DNA的转化①分别用2个100µl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面操作：第一组，质粒DNA组：10µlpBS质粒DNA+100µl感受态细胞悬液第二组，空白对照组，10µl无菌水＋100µl感受态细胞悬液②将以上各样品轻轻混匀，冰上放置30min，于42℃热激90s，然后迅速冰上冷却2min；③立即向上述管中

6、分别加入0.4mlLB液体培养基（在超净工作台操作，不需要在冰上），使总体积到0.5ml，摇匀后于37℃振荡培养约30min，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Amp)；④在超净工作台取各样品培养液0.1ml在平板上涂布，分别接种于含Amp抗菌素的LB平板培养基上（做好标记，日期）,涂匀；⑤在菌液完全被培养基吸收后，培养皿倒置于37℃培养箱中过夜(12-16小时)；⑥观察转化子出现的情况，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养。五、注意事项①防止杂菌和杂DNA的污染：整个操

7、作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。②感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响到其转化率，因此应尽量减少常温操作，动作要迅速。③为减少对细胞的机械损伤，操作时动作不能剧烈。④尽量在无菌状态下操作，减少污染的可能。六、质粒DNA转化常见问题对策原因1.感受态细胞低效2.抗生素使用错误3.转化后立即涂板忘记温浴1.使用

8、高效率的感受态细胞（106以上）2.复查质粒抗性，使用正确的抗生素3.转化后温浴30min左右，让抗性基因得以表达七、问题与讨论1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？2.如阴性对照中长出菌，原因？3.还有哪些方法可以将外源基因导入受体细胞？各有什么优缺点？如果转化成功，由于质粒DNA上带有Amp抗性基因导致本来Amp敏感的菌株也可以在含有Amp的LB固体培养基上生长，如图1。如转化不成功则Amp敏感的菌株和阴性对照不会在含有Amp的LB固体培养基上生长，如图2。图1图2