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1、实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备与转化【实验目的】学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理与技术。学习大肠杆菌转化的原理与技术。【实验原理】在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。转化(Transfo
2、rmation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。其原理是细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细菌表面，经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。将经过转化后的细胞在筛选培养基
3、中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。CaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)。本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pUCm-T质粒（T-载体）共保温，实现转化。由于pUCm-T质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pUCm-T，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导
4、入了pUCmT。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。【设备、材料与试剂】一、设备恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液枪。二、材料E.coliDH5α菌株:Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pUCmT质粒DNA:购自上海生工生物工程有限公司。三、试剂1.LB固体和液体培养基2.Amp母液3.含Amp的LB固体培养基4.SOC液体培养基5.0.1mol/LCaCl2溶液【实验步骤】一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落,接种于20mlLB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直
5、至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100mlLB液体培养基中,37℃振荡培养1-2小时至OD600＝0.5左右。二、感受态细胞的制备(CaCl2法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10-30分钟，然后于4℃下5000rpm离心10分钟。2、弃上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液30ml轻轻悬浮细胞，冰上放置10分钟后，4℃下5000rpm离心10分钟，弃去上清。3、每50ml初始培养物用200µl预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液重悬每份细胞沉淀，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。三、转化1、取200μl感受态细胞悬液，转移至无菌的微量离心管中，
6、置冰上。2、加入连接产物10μl，轻轻摇匀，冰上放置60分钟。3、42℃水浴中热击2分钟，热激后迅速置于冰上冷却2分钟。4、向管中加入800µlSOC液体培养基(不含Amp)，混匀后37℃振荡培养30分钟，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。（其间可以将IPTG7µl和X-Gal40µl涂布于预制的Amp平板上）。5、将上述菌液以3000rpm离心20秒，弃大部分上清，用剩余的100μl上清重悬菌体，涂布于含Amp的筛选平板上（已涂布IPTG7µl和X-Gal40µl），正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。同时做
7、两个对照:对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。附录：LB液体培养基：胰蛋白胨1％酵母提取物0.5％NaCl1％用NaOH调pH至7.0，定容至1L，灭菌。含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后
