实验-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化.ppt

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1、实验二大肠杆菌感受态细胞的制备及转化内容一：大肠杆菌感受态细胞的制备实验目的实验原理实验仪器、材料、试剂实验步骤1234注意事项思考题56实验目的掌握感受态细胞的概念及其意义。掌握感受态细胞的制备原理与操作方法。实验原理感受态：受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。制备感受态的细胞一般选择对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。常用的感受态制备方法包括KCl、CaCl2等方法；后者因为操作简便且符合大多数的分子克隆要求，

2、因而被广泛采用。CaCl2法的基本原理：细菌处于低温（0℃）和低渗的CaCl2溶液中，菌体膨胀，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42℃进行短时间的热激处理，促进DNA的吸收。实验原理CaCl2法简便易行，用CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒DNA产生5106-2107个转化菌落。在实际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。制备出的感受态细胞暂时不用时，加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃，可以保存半年。实验原理提高转化

3、效率要考虑几个重要因素：实验原理1、细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右。2、质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的超螺旋态DNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。

4、一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。实验原理3、试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的，并用超纯水配制，并用微孔滤膜过滤灭菌，最好分装保存于干燥的冷暗处。实验原理4、防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。实验原理实验仪器、材料、试剂1、仪器：高压灭菌锅、恒温水浴锅、台式离心机、无

5、菌操作台、微量移液器、恒温摇床；2、材料：菌种E.coliDH5α；3、试剂：LB液体培养基、0.1MCaCl2。1、将E.coliDH5α单菌落接种于3mlLB培养液中，37℃震荡培养过夜。2、取30μl液体培养液加入3mlLB液体培养基中，37℃下震荡培养，至光密度值OD600在0.5~0.6之间（5×107个/ml）。3、取1mlE.coli液体培养液于1.5ml的离心管中，4000rpm，4℃离心3min。实验步骤4、快速的吸除上清，向沉淀中加入1ml冰冷的0.1MCaCl2溶液，使沉淀充分悬浮，动作要轻柔，置于冰上30min，

6、4000rpm，4℃离心3min。5、弃上清，加入lml冻存液（含15%甘油的0.1MCaCl2溶液）溶液，使沉淀充分悬浮，以每管0.1ml的规格分装3管，冻存于-80℃，可保存4~6个月。实验步骤注意事项1、不要用经过多次转接或储存与4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。2、细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可以通过监测培养液的OD600控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。注意事项3、进行热激制备感受态细胞时要控制好时间。4、悬浮细胞时

7、动作要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。思考题1、影响感受态细胞转化效率的因素有哪些？内容二：质粒DNA的转化与转化体筛选实验目的实验原理实验仪器、材料、试剂实验步骤1234注意事项思考题56实验目的了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞及筛选重组子的方法。实验原理转化：指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌细胞，并使其生物学特性发生可遗传的变化的过程，是基因工程等研究领域的基本实验技术。转化的方法：(1)化学的方法(热激法)：使用化学试剂(如CaCl2)制备的感受态细胞，通过热激处理将

8、载体DNA分子导入受体细胞；(2)电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。实验原理用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感受态后，通过热激处理可将质粒转