大肠杆菌感受态细胞制备与转化.docx

《大肠杆菌感受态细胞制备与转化.docx》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、大肠杆菌感受态细胞制备实验（CaCl2法）细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenentcells）。1实验方法原理：带有外源DNA的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA的载体分子通过。2实验材料、试剂、仪器耗材：E.coliDH5α菌株LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫

2、酸镁、SOB、TFB等培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等3实验步骤：1、从37℃培养16-20h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3mm)，转到一个含有100mlLB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3h。一般经验，1OD600约含有大肠杆菌DH5α109个/mL。2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。3、于4℃用SorvallGS3特头（或与之相当的转头）以4100r/min离心10min

3、，以回收细胞。4、倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。5、每50ml初始培养液用30ml预冷的0.1mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80mmol/LMgCl2，20mmol/LCaCl2)重悬每份细胞沉淀。6、于4℃用SorvallGS3转头（或与之相当的转头）以4100r/min离心10min，以回收细胞。7、倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。8、每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。9、此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于-70℃。4注意事项：1.为达到

4、高效转化，活细胞数务必少于108个细胞/mL，对于大多散大脑杆菌来说，这相当于OD值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15-20min测定OD600值来监测，用监测的时间及OD值列一个图表，以便预测培养物的OD600值到0.4的时间，当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。2.在菌株与菌株之间，OD值与每毫升中活细胞散间的关系变化很大，因此有必要通过漶量特定脑杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值，并将各稀释维度的培养物铺于无抗生素的LB琼脂板以计算每一时相的活细胞散，从而使分光光度计读数得到标准化。3.对大多数大肠杆菌（MC106除外），采用T

5、FB代替CaCl2可得到相同或更好的结果。Dagert和Ehrlieh的实验(1979)曾表明，细胞可以于4℃在CaCl2溶液中保存24-48h，在贮存的最初12-24h内，转化率增加4-6倍，然后降低到初始水平。4.克隆的新鲜程度，一定要选新鲜平板的单克隆，即刚涂布生长过夜的平板。5.菌体的OD600值，JM109或BL21，OD值为0.35，DH5α为0.4，要尽量保证OD值不要过高，更不能超过0.6。6.低温处理的时间，做完后冰上保存12-24h后分装，并保存于-80℃。7.试剂和用品，所有的用品（离心管、药瓶等）用新的，如果使用旧的，要确保干净，CaCl2溶液。转化（热击法）大

6、肠杆菌转化可以：（1）将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制，增殖和表达，以获得目的基因；（2）验证大肠杆菌感受态细胞效果；（3）用于分子生物学其他研究。1原理：质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。2器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。3材料和试剂：质粒DNA，重组DNA，培养基

7、（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。4实验准备：无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2%X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。5操作步骤：（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。（2）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。（3）加入5μl连接好的质粒混