大肠杆菌感受态细胞制备及转化

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1、大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验目的掌握制备和保存大肠杆菌感受态细胞的方法掌握转化的方法技术了解转化过程中各因素对转化率的影响感受态及转化实验原理定义感受态（Competence)：细菌处于容易吸收外源DNA的状态转化（transformation)：异源DNA分子导入受体细胞的过程致敏过程:用理化方法诱导细胞进入感受态的操作在生长周期的任何时刻自动产生感受态；（e.g.枯草杆菌）在生长周期的特定时刻产生感受态；（e.g.大肠杆菌）细菌产生感受态的类型受体菌与质粒的选择受体菌：E.ColiDH5α：无Ap抗性外源质粒Ampr抗性基因编码一种周质酶

2、（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力选择:如进行蓝白斑筛选时可选用DH5α、JM109、TG1；用T7启动子进行原核表达时可选用BL21(DE3)；制备感受态细胞方法原生质体法电击法特殊试剂诱导法：CaCl2诱导法+质粒DNA420C热击复苏Amp+细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面,经短时间420C热击处理,促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放在非选择性培养基上保温一段时间，使抗氨苄青霉素的表型表达后再转到含氨苄青霉素的选择性培养基上

3、，长出来的菌即为转入了外源基因的菌株。转化率定义及计算公式：转化子数/ugDNA=单菌落数质粒浓度(ng/ul)X1uL2.5ng/uLX10x1000影响转化效率的因素细菌的生长状态：大肠杆菌在对数中期易产生感受态OD值：0.3－0.5(5X107个/ml)试剂的质量：化合物及无机离子：Rb+、Mn+、二甲亚砜等质粒：大小、构型外源DNA（质粒）与细胞的比例：器皿的洁净度污染—尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行感受态细胞的保存制备好的感受态细胞每100uL分装一支EP管轻轻混匀----可以用tip头轻轻搅匀.4℃保存（不加甘油），可保存一周

4、；加30%甘油，-20℃保存，可保存一月；加30%甘油，80℃保存，可保存六月；实验器材摇床分光光度计冷冻离心机超净工作台恒温水浴涂布棒恒温培养箱实验试剂LB液体培养基LB固体培养基氨苄青霉素0.1MCaCl230%甘油实验流程1、接单菌落到5mlLB液体培养基中，370C、190rpm振荡培养过夜2、5%（250ul)菌液接种到含5mlLB的试管中，370C振荡培养1-2小时，至OD6000.4-0.5（已完成）3、将1.5mL菌液转移到离心管中4、离心5000rpm，40C，5min5、倒出培养液6.用冰预冷的1mL0.1M的CaCl2处理、悬

5、浮细胞，7.冰上20min8.(取1.5mL)5000rpm离心5min，倾去上清9.100uLCaCl2轻轻悬浮，冰浴大肠杆菌DH5α感受态的制备实验流程大肠杆菌DH5α受态的制备--------1ml-----------20min实验流程质粒的转化1.实验样品:吸取50uL感受态细胞到另一个1.5mlEP管中，加入1uL质粒（枪头轻轻混匀，勿吹打）2.阴性对照：DH5α感受态细胞50uL冰浴20mins42℃90秒（静置，勿摇动）迅速放到冰上,冰浴2mins加入950uLLB培养基，标明组号，37℃200rpm摇床培养45mins制备LB琼脂

6、平板(已完成)含Ap的LB固体培养基倒平板,每组5个.（编号1,2,3,4,5）不含Ap的LB固体培养基平板。（编号6）涂布样品(转化培养后的菌液),涂布于1,2,3,4,5号平板，各100uL。阴性对照(转化培养后的菌液)100uL：涂布于6号平板。静置15mins,倒置平板37℃培养过夜涂布棒的使用酒精灯的使用使用前，浸入75%酒精中；在酒精灯上引燃涂布棒上的酒精（不要烧到手）；等酒精烧完后，让涂布棒在空气中冷却；涂布均匀；将涂布棒重新除菌以备下一次使用。观察结果（明天上午）预期实验结果：1-4号平板上出若干单菌落，说明？5号平板上没有可见菌落

7、，说明？6号平板上出现大量菌落，说明？计数单菌落,计算转化率.如阴性对照中长出菌，可能原因是什么？菌的密度过高或培养时间过长时会在阳性菌的周围长出一些小的卫星菌落，它们是非Amp抗性的，试分析原因。思考题