大肠杆菌感受态细胞的制备及转化.ppt

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1、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化制作人：李国婧内蒙古农业大学生物化学与分子生物学实验教学中心实验原理实验仪器实验试剂实验步骤注意事项实验原理电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为109～1010转化子/µgDNA。热激法是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106～107转化子/µgDNA。实验仪器1．超净工作台2．低温离心机3．恒温摇床4．恒温培养箱5．-70℃冰箱6．制冰机7．移液

2、器50ul、200ul、1000ul实验试剂１．氨苄（母液50mg/ml，终浓度为50ug/ml）：2ml母液需氨苄100mg２．CaCl2(终浓度20mM)：需贮液1M、20ml，需CaCl2固体4g３．MgCl2(终浓度80mM)：需贮液1M40ml，需MgCl2固体4g４．甘油：500ml实验步骤CaCl2感受态细胞的制备实验步骤电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤CaCl2感受态细胞的制备实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100mlL

3、B培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1MCaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作；4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入100l预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟；8．弃去上清，加入100l预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷

4、冻保护剂（15%-20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。电转化法制备大肠杆菌感受态细胞实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；2．取2ml过夜培养物转接于200mlLB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600＝0.6（约2.5-3小时）；3．将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作；4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入1500l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，

5、使细胞重新悬浮；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟8．弃去上清，加入750l冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．4℃下3000g冷冻离心5分钟10．加入20l冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11．立即使用或迅速置于-70ºC超低温保存。注意事项1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3．经CaCl2处理的细胞，在低温条

6、件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；5．所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；7．一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；