大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(jin lab)

大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(jin lab)

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时间:2018-09-26

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1、大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(JinQuan-WenLabatXMU)一、大肠杆菌电转化感受态细胞制备:第一天:1.用枪头或接种环挑取单克隆菌落,接种入盛有5mlLB液体培养基的培养管中,可以准备两管。37°C,220rpm,培养过夜(14-16个小时)。2.高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)和几个50ml离心管,以备第二天离心收集细菌用。3.准备几瓶灭菌水(总量约1.5升),保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细菌细胞用。第二天:1.取2-5ml过夜培养液,接入500mlLB(或2XTY)液体培养基中,控制起始OD600=0

2、,03-0,05。37°C,220rpm,振摇2-4小时,每半小时测一次OD,当OD值达到0.4时,停止培养。2.将菌液在冰上预冷30分钟。同时,开启离心机,预冷至4°C。3.随后将菌液分装到250ml或500ml预冷的离心瓶中,4°C,4000rpm离心15分钟。4.弃上清液,先用少量(如20-50ml)灭菌的冰水重悬沉淀的细胞团,然后加水稀释至离心瓶的2/3体积,充分悬起细胞(可以用手握住瓶体上部震荡!)。4°C,4000rpm离心15分钟。5.弃上清液,加少量灭菌水,重悬菌体,再加水至所有细胞悬浮约500ml冰水中。4°C,400

3、0rpm,离心15分钟。6.弃上清,往离心管中加入少量10%甘油(灭菌,预冷),重悬菌体,再加10%甘油至终体积约为20ml。4°C,4000rpm,离心10min。7.小心弃去上清(沉淀可能会很松散!),加入2ml10%甘油(灭菌,预冷)重悬浮细胞。8.将悬浮菌液以200ul/管分装于1.5ml的Ep离心管中,在液氮中快速冷冻后,于-70°C冰箱中保存。9.检测转化效率:取100ml新鲜制备的感受态细胞,加入0.01ng已知浓度的plasmidDNA,电转化后,将重悬在1mlSOC培养液并复苏的细胞分别取10ml(1%)和100ml(

4、10%)涂板,估测转化效率。*Optimalefficiencyisca.1X108cfu/µgDNAforgeneralcloning.**Forlibrarytransformation,efficiencywithca.1X109cfu/µgDNAisrequired.感受态细胞制备简要流程:收集细胞à冰水冲洗细胞2次à10%甘油冲洗细胞1次à重悬细胞在10%甘油à分装二、电转化[连接产物、纯化质粒或质粒文库]:1.从-80°C冰箱中取出感受态细胞,置于冰上解冻。2.将无菌的电击杯置于冰上预冷。3.将解冻的感受态细胞按照40~10

5、0ul/管转移至预冷的1.5ml的离心管中,小心混匀,冰上放置。4.取1-2µl纯化的质粒或克隆连接产物于1.5ml的离心管中,冰上放置10min。[加入的DNA体积过大时,其中的盐会造成电击时产生电火花!]5.打开电转仪[Bio-RadGenePulserSystem],调至Manual,调节参数设置为25µF,200OHMs,电压为2.0kV[这些参数设置可以根据经验略作调整]。6.将此混合物转移至已预冷的电击杯中,轻轻敲击电击杯使混合物均匀进入电极杯的底部。用吸水纸吸干电击杯外壁的冰水。7.将电击杯推入电转化仪,按一下pulse键

6、,听到蜂鸣声后,向电击杯中迅速加入2X500ml的SOC液体培养基,重悬细胞后,转移到1.5ml的离心管中。8.37°C,220-250rpm复苏1小时。9.离心,涂板,置于37°C,过夜培养,次日查看转化结果。三、电击杯的清洗和保存:1.用清水将用过的电击杯稍微冲一下,向电击杯中加入75%酒精冲洗。2.弃去酒精,再用蒸馏水冲洗2~3遍,然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10次以上。3.加入无水乙醇1-2ml于电击杯中,浸泡5分钟。4.弃去无水乙醇,将电击杯倒置于吸水纸上让乙醇充分挥发。5.将清洗并干燥好的电击杯加上盖子,存放备用

7、。几种可以选用的细菌培养基:200ml500ml1000mlLB1gyeastextract2gtryptone(orpeptone)2gNaCl2.5gyeastextract5gtryptone(orpeptone)5gNaCl5gyeastextract10gtryptone(orpeptone)10gNaCl2´TY3.2gTryptone2gYeastExtract1gNaCl[用5NNaOH调pH值至7.0]8gTryptone5gYeastExtract2.5gNaCl[用5NNaOH调pH值至7.0]16gTrypton

8、e10gYeastExtract5gNaCl[用5NNaOH调pH值至7.0]SOC4gTryptone1gYeastExtract0.1gNaCl2mlKCl(250mmol/L)1mlMgCl2(2mo

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