大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备.doc

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1、3.大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备　　　电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，同时，DNA在电场力的作用下进入细胞，随后细胞复苏和弥合，从而实现质粒DNA的物理转移。为避免电击时出现“击穿”，即产生电流，细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为109～1010转化子/µgDNA。3.1．感受态细胞的制备（1）感受态细胞及材料准备同钙转化感受态细胞的制备相同。（2）选合适的大肠杆菌在4℃，3000rpm下离心10min，弃上清液（如需要，沉淀可在4℃的10%甘油中保存1～2天）。（3）弃上清，离心管中加入少

2、量ddH2O，轻柔的悬浮沉淀后，再将水注满离心杯，4℃，3000rpm离心10min。（4）重复步骤（3）1次。（5）小心弃上清（沉淀可能会很松散），再往离心管中加入少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加满10%甘油，4℃，4000rpm离心10min。（6）用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2～3ml，将细胞按200μl等份装入微量离心管，放置于－80℃下保存。（7）按照钙转化感受态细胞方法进行转化效率和抗性检测。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

3、　　　　　　　　　　3.2．电转化为了降低离子浓度，待转化的质粒DNA，如质粒或酶连产物，在电转化前应该进行纯化（乙醇沉淀），以下所有步骤都需要保持无菌操作。（1）从－80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；加入待转化的质粒DNA，冰浴10min；同时将电转化杯进行冰浴。实际操作中，如果电转化杯浸泡在乙醇中，可提前取出电转化杯，在无菌的超净台上吹干。（2）打开电转仪，调至Manual，调节电压为2.1KV。特别注意，不同的电转化杯，所使用的电压不同。防止电压不够，难以有效转化，以及，电压过高，击爆电转化杯，产生火

4、花，产生危险。（3）将冰浴后的感受态细胞（含DNA）转移到电转化杯中，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部（注意：其体积以填充电转化杯到电极之间空间即可，具体的用量可参见具体所使用的电转化杯的说明）。（4）将电极杯推入电转化仪中，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入800μl的LB液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。（5）37℃，220～250rpm复苏40min。（6）按照钙转步骤进行涂板培养。【电击杯清洗流程】（1）用清水将电击杯稍冲一下。（2）向电击杯中加入75%酒精浸泡

5、2h。（3）去酒精，再用蒸馏水冲洗2～3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。（4）加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30min。（5）去无水乙醇，于通风厨内挥发干乙醇。（6）将清洗好的电击杯放入－20℃冰箱内待用。【注意】不同样品使用的电转化杯应分开；若长期不用，应将清洗好的电转化杯浸泡在乙醇中。亲爱的用户：烟雨江南，画屏如展。在那桃花盛开的地方，在这醉人芬芳的季节，愿你生活像春天一样阳光，心情像桃花一样美丽，感谢你的阅读。1、最困难的事就是认识自己。21.8.228.22.202118:371

6、8:37:14八月-2118:372、自知之明是最难得的知识。二〇二一年八月二十二日2021年8月22日星期日3、越是无能的人，越喜欢挑剔别人。18:378.22.202118:378.22.202118:3718:37:148.22.202118:378.22.20214、与肝胆人共事，无字句处读书。8.22.20218.22.202118:3718:3718:37:1418:37:145、三军可夺帅也。星期日,八月22,2021八月21星期日,八月22,20218/22/20216、最大的骄傲于最大的自卑都表示

7、心灵的最软弱无力。6时37分6时37分22-八月-218.22.20217、人生就是学校。21.8.2221.8.2221.8.22。2021年8月22日星期日二〇二一年八月二十二日8、你让爱生命吗，那么不要浪费时间。18:3718:37:148.22.2021星期日,八月22,2021