大肠杆菌感受态细胞的制备和转化.docx

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1、第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第一节概述在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。转化(Transformation是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ,它可以容忍外源DNA分

2、子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl等化学试剂法的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl法,RbCl(KCl法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般

3、实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年,因此CaCl2法为使用更广泛。为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素:1.细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌,最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同,这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2.质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DN

4、A(cccDNA。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。3.试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.,并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。4.防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转

5、入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr,可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS,则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞(转化子肯定已导入了pBS。转化子扩增后,可将转化的质粒提取出,进行电泳、酶切等进一步鉴定。本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr,可通过A

6、mp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS,则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞(转化子肯定已导入了pBS。转化子扩增后,可将转化的质粒提取出,进行电泳、酶切等进一步鉴定。第二节材料、设备及试剂一.材料E.coliDH5菌α株:Rˉ,Mˉ,Ampˉ;质pBS粒DNA:购买或实验室自制,eppendorf管。二.设备恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,制冰机,分光光度计,微量移液枪。三.试剂1.LB固体和液体培养基:配方见第一章。2.Amp母液:配方见第一章。3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养

7、基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。4.麦康凯培养基(MaconkeyAgar:取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌,待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板。5.0.05mol/LCaCl2溶液:称取0.28gCaCl2(无水,分析纯,溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。6.含15%甘油的0.05mol/LCaCl2:称取0.28gCaCl2(无水,分析纯,溶于