大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化课件.ppt

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1、实验题目大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化主讲：张杰生物实验教学中心酶酶限制性核酸内切酶逆转录酶DNA连接酶末端转移酶大肠杆菌DNA聚合酶ⅠS1核酸酶Klenow酶DNA酶ⅠTaqDNA聚合酶RNA酶A多核苷酸激酶碱性磷酸酶基因工程操作中最常用的工具酶主要内容1限制性核酸内切酶2DNA连接酶3DNA聚合酶4修饰酶酶主要用途限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，切割DNA分子DNA连接酶连接两个DNA分子或片段大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ或Klenow酶1制作DNA探针；2合成cDNA第二链；3填补

2、双链DNA3`凹端；4DNA测序。TaqDNA聚合酶聚合酶链式反应（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸5`-OH磷酸化，制末端标记探针末端转移酶使3`-末端加同聚物尾S1核酸酶降解单链DNA或RNADNA酶Ⅰ在双链DNA上产生随机切口RNA酶A降解RNA逆转录酶补平反应，合成cDNA或制探针磷酸酶切除核酸末端磷酸基SUMMARY1限制性核酸内切酶1.1引言--核酸酶和限制性核酸内切酶的定义1.2限制性核酸内切酶的命名1.3限制性核酸内切酶的分类1.4限制性核酸内切酶活性及其影响因素Home核酸酶（Nucl

3、ease）：通过切割相邻两个核苷酸残基之间磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。1）按作用对象可分为:Deoxyribonuclease(DNAase)&Ribonuclease(RNAase)2）按水解断裂核酸分子不同方式可分为：Endonuclease&Exonuclease1.1引言--核酸酶和限制性核酸内切酶的定义限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease):指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。限

4、制酶天然存在于细菌体内，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统（Restriction-ModificationSystem)。Back1.2限制性核酸内切酶的命名命名原则：第一个字母（大写,斜体）：该酶来源的微生物属名；第二、第三个字母（小写、斜体）：微生物的种名；若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个字母（大写）若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。例如：EcoRⅠ从大肠杆菌（Escherichiacoli)R株分离的第一种限制

5、酶命名为EcoRⅠ，其中E代表属名（Escherichia)，co代表种名（coli)，R代表株系（RY13），Ⅰ代表该菌株中首次分离到。Back1.3限制性核酸内切酶的分类1.3.1Ⅰ型限制性内切酶1.3.2Ⅱ型限制性内切酶1.3.3Ⅲ型限制性内切酶1.3.1型限制性内切酶功能：限制、修饰特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；识别位点和切割位点不一致，没有固定切割位点（随机性）；应用：不常用。1.3.2型限制性内切酶功能：限制、修饰特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；

6、特异切割，切割位点在识别位点外，距识别位点3`端24-26bp处。应用：数量很少，分子克隆中无实际作用。1.3.3型限制性内切酶功能：识别并特异切割DNA分子。即通常所指的DNA限制性核酸内切酶；反应特点：仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，能识别双链DNA的特殊序列，并可特异切割DNA，产生特异性的片段；应用：种类繁多，分子克隆中最常用的内切酶。Back(1)基本特性识别长度为4-8个核苷酸的特异序列；许多识别序列具回文结构，如HindⅢ的识别序列：5`AAGCTT3`3`TTCGAA5切割产生的

7、末端有粘端(cohesive/stickyend)如BamHI(G↓GATCC)和平端(bluntend)如SmaI(CCC↓GGG)EnzymeRecognitionseuqenceEnzymeRecognitionseuqenceBamHIG↓GATCCPstICTGCA↓GBglIIA↓GATCTSalIG↓TCGACEcoRIG↓AATTCSau3AI↓GATCHindIIGTPy↓PuACSfiIGGCCNNNN↓NGGCCHindIIIA↓AGCTTSmaICCC↓GGGKpnIGGTA

8、C↓CXbaIT↓CTAGANotIGC↓GGCCGCXhoIC↓TCGAGRecognitionSequencesandCuttingsitesofselectedRestrictionEndonucleases(2)同功异源酶来源不同但能识别和切割同一位点的酶称为同功异源酶(isoschizomer),有时也称同裂酶。如：BamHI(G↓GATCC)和BstI(G↓GATCC)有一些同功异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感度有所不同。(3)同尾酶有些限制酶识别序