ecoli感受态细胞的制备、质粒dna的转化、提取与酶切鉴定

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1、实验54E.Coli感受态细胞的制备、质粒DNA的转化、提取与酶切鉴定制作人：刘如石一.实验目的和要求1、通过本实验了解和掌握氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和质粒DNA转化受体菌细胞的原理与技术；2、了解质粒DNA的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒DNA的方法；3、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法；通过本实验了解大肠杆菌感受态细胞制备、DNA转化、限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作用。二.实验原理1、感受态细胞制备:所谓感受态是指受体细胞处于容易吸收外源DNA的一种

2、生理状态，可以通过物理与化学方法诱导形成，也可以自然形成，在基因工程技术中通常采用诱导的方法。用于转化的受体菌细胞一般是限制-修饰系统（Restriction-Modification）缺陷的变异株，以防止对导入的外源DNA的切割，用符号R-M-表示。其基本原理是：细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经过42℃短时间的热激处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并

3、分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子。2、碱裂解法小量制备质粒DNA：碱裂解法是基于线性大分子染色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的的，在pH12.0～12.6的碱性环境中，线型染色体DNA和环型质粒DNA氢键会发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分离；当将pH值调节到中性并在高盐浓度下，已分开的染色体DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构，通过离心，大部分染色体DNA、不稳定的大分子RNA和蛋白质-SDS复合物等

4、一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合环状的质粒DNA在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，离心后上清中便含有所需要的质粒DNA。3、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、III型三大类，Ⅰ类和III类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点

5、，但却随机地切割回转到被结合处的DNA。Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故Ⅰ类和Ⅲ限制酶在基因工程中基本不用，II类酶在分子克隆中使用广泛，其基本特点如下：(1)、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如EcoRI识别与切割序列为5`····GAATTC····3`3`····CTTAAG····5`(2)、识别的核苷酸数目大多数为4～6个，少数识别8～13个；(3)、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大多数酶产生的是具有凸出的粘性末端：(4)、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的

6、序列，甚至切割的位点也相同，称为同裂酶或异源同工酶，如HpaII与MspI；有的识别位点不同，但对DNA切割后可产生相同的粘性末端，称为同尾酶，如BamHI与BglII。影响核酸限制性内切酶活性的因素：DNA的纯度；DNA的甲基化程度；酶切消化反应的温度；DNA的分子结构；溶液中离子浓度及种类；缓冲液的pH值。4、琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖溶化再凝固后能形成带具有一定形状、大小与孔隙度的固体基质(密度与琼脂糖浓度相关)；而生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中磷酸基团呈离子化状态，因此将核酸分子置于电场中时，它们会

7、向正极迁移，由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以同样的速度向正极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构象。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移速率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快。直接用低浓度的EB进行染色，可确定DNA在胶中的位置。影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素：DNA的分子大小；琼脂糖浓度；DNA构象；电场强度；碱基组成与温度；嵌入染料的

8、存在；电泳缓冲液的组成。三．实验材料与设备：1、用品与与仪器：超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等；1.5mL与0.5mLEppendorf管、tip头、烧杯、量筒镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸，一次性塑料手套等；E.coliDH5α受体菌(R-