dna片段的分离和回收，质粒dna的连接和转化.ppt

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1、实验五琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收玻璃奶法分离回收琼脂糖凝胶中DNA片段质粒DNA的连接和转化第一部分琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收——玻璃奶法分离回收琼脂糖凝胶中DNA片段实验目的：掌握利用玻璃奶法从琼脂糖凝胶中分离回收DNA片段的原理和操作技术;了解其他几种方法的原理与操作技术。DNA片段分离回收常用方法：电洗脱法低熔点琼脂糖凝胶法DEAE滤膜插片法玻璃奶法电洗脱法将含DNA片断的凝胶放在一个用半透膜隔离的空间中，通过电泳的电流使得DNA离开凝胶进入液相。回收液相后纯化沉淀其中的DNA分子。低熔点琼脂糖凝胶法

2、将切好的回收胶块放在回收胶槽内，在切去胶块处加入低熔点琼脂糖胶，待其凝固后将其小心放回电泳槽继续进行电泳。待目的带完全进入低熔点琼脂糖胶后，在长波紫外灯下切下含有所需DNA带的凝胶条，置于新的EP管中，加300µLTE。65℃水浴10min或更长使胶块完全融化。酚氯仿抽提DNA，乙醇沉淀。DEAE滤膜插片法将DEAE纤维素膜裁成小条活化处理。电泳后在目的条带前切一刀，将比条带略宽的DEAE纤维素膜插入切口，不留气泡，继续电泳一会儿，条带上的DNA被膜片截留。取出膜片冲洗后转移到离心管中加缓冲液65度保温洗脱，直到膜上没有D

3、NA了，将溶液用酚氯仿抽提沉淀。这个方法不适合做较大的DNA，因为洗脱比较困难。玻璃奶法实验原理：玻璃奶(Glassmilk)：无毒、无味、无腐蚀作用的白色硅颗粒，能专一性结合0.2kb至50kb大小的DNA（双链、单链、线性、环状或超螺旋），不结合RNA、蛋白质、寡核苷酸、有机溶剂、去污剂及其他可能抑制酶活性的有机或无机物。DNA与玻璃奶结合原理：在高盐状态下，玻璃奶周围的负电荷被打破，并允许DNA的磷酸负电荷与玻璃奶特异性结合。在低盐（H2O/1×TE）时溶解分离。DNA结合率影响因素：盐浓度：DNA<100bp:高盐

4、状态下结合率高。DNA>100bp:低盐状态下结合率高。pH值：pH<7.0:结合率高。应用：从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段；从DNA反应物中纯化目的DNA片段，如回收纯化PCR产物、酶切连接反应中的DNA片段；从探针制备反应中去除未标记上的核苷酸以及小的DNA片段（比如引物）；DNA浓缩，去盐及去除杂质。本方法的优点：高纯度：回收的DNA片段基本上不含RNA、蛋白质及其它有机分子，可直接用于酶切、连接、探针制备、序列测定等；简便：所需主要仪器是一架台式离心机；快速：整个回收过程只需半个小时；高效：回收效率达到70%以上

5、；多用途：可以用于胶回收、PCR产物回收、DNA片段及探针的纯化浓缩等；安全：不接触苯酚、氯仿等有害物质。实验材料：使用Omegabio-Tek胶回收试剂盒（Ultra-SepGelExtractionKit）Ultra-SepBindingBuffer300mlUltra-SepBeads5.5mlDNAWashBuffer2×80mlElutionBuffer60ml超纯水无水乙醇方法和步骤：琼脂糖/EB凝胶电泳分离DNA片段切取所要的DNA条带溶解琼脂糖/EB凝胶结合玻璃奶离心沉淀玻璃奶洗脱DNADNA产量和质量测定

6、1．琼脂糖/EB凝胶电泳分离DNA片段。2．紫外灯下切取所要的DNA条带。3．将切下胶块放入1.5mlEP管中，称重，以确定胶条的体积。设定胶的密度为1g/ml，例如0.2g胶认为其体积为0.2ml。4.加入等体积的Ultra-SepBindingBuffer。对长度低于400bp的DNA片段或大于2%琼脂糖凝胶，加入3×体积的BindingBuffer。方法和步骤：5．涡旋震荡悬浮Ultra-SepBeads，加入10µlUltra-SepBeads到样品EP管中。50～55℃温育10min或时间至完全熔解。在温浴过程中

7、，每隔2min震荡EP管悬浮Ultra-SepBeads。注意观察胶完全熔解后胶/BindingBuffer混合物的pH值。当混合物pH＞8.0则DNA的产量将会显著减少。如果混合物变为橙色或红色，则加入5µl5MNaAC（pH5.2）以降低pH值。加入NaAC后混合物的颜色应该变为淡黄色。6．10,000×g室温离心1min，使Ultra-SepBeads沉淀，弃上清。7．加入300µlUltra-SepBindingBuffer，涡旋震荡Ultra-SepBeads以洗涤玻璃奶。10,000×g室温离心1min，弃上清

8、。8．加入750µl预先按瓶上标签说明用无水乙醇稀释的DNAWashBuffer。涡旋震荡重悬玻璃奶，10,000×g离心1min，沉淀玻璃奶。9．弃上清并彻底去除离心管残余液体。空气中干燥5～10min。10．向管中加入15～50µl（按最终产物浓度确定加入体积）ElutionBuffer（10mMT