DNA 酶切、回收和连接.ppt

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1、实验七基因片段的亚克隆(DNA的酶切、回收和连接）一.实验目的掌握DNA酶切的基本原理。学习和了解限制性内切酶的使用方法。学习和掌握DNA片段胶回收的方法二.实验原理1.核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链DNA中特定碱基序列的核酸水解酶，它们的功能类似于高等动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的侵袭。现已发现几百种限制性内切酶，它们以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH。由于限制性内切酶能识别DNA特异序列并进行切割，因而在基因重组、DNA序列分析、基因组甲基化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技术中收到广泛应用。2.DNA的酶切反应

2、分子生物学中经常使用的是II型限制性内切酶。它能识别双链DNA分子中特定的靶序列（4～8bp),并在该序列内切断DNA，形成特有的粘末端或平端。3.DNA的连接在T4DNA连接酶的作用下，平端或带有相同粘末端的DNA分子可以连接上。DNA连接酶的作分三步：T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物。酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’羟基切口的DNA分子上，使DNA腺苷化。产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。三.试剂与器材〈一〉试剂限制性内切酶EcoRI,HindIII；10×内切酶缓冲液T4DNA连接酶；10×连接酶缓冲液电泳缓冲液（0.5×TBE或1×TAE）琼

3、脂糖；溴酚兰；溴化乙锭(工作浓度0.5µg/ml)酚；氯仿；无水乙醇；70%乙醇；灭菌双蒸水Note:Concentration:  20,000and100,000units/ml.AssayedonlambdaDNAStorageConditions:  250mMNaCl,10mMTris-HCl(pH7.4),0.1mMEDTA,1mMdithiothreitol,0.5mg/mlBSA,and50%glycerol.Storeat-20°CDiluentCompatibility:DiluentBHeatInactivation:  65°Cfor20minutesNotsen

4、sitivetodam,dcmormammalianCpGmethylationConditionsoflowionicstrength,highenzymeconcentration,glycerolconcentration> 5%orpH>8.0may resultinstaractivity双酶切buffer的选用〈二〉实验器材1．电泳仪、电泳槽、紫外检测仪、摄影设备2．恒温水浴槽四.操作步骤酶切反应设计酶切体积为20~30μl，计算清楚酶切系统中各成分的用量，清晰做好记录，如果是同一条件下进行多个酶切反应，建议统一加好共同的组分后，分装；先加入正确体积的无菌双蒸水，加入1/10

5、体积的10x酶切缓冲液，混匀；在冰浴条件下加入适量的限制性内切酶；加入适量的DNA样品；弹匀，短暂离心；置所用限制性内切酶最适温度水浴中，酶切1~3小时，酶切过夜则建议改用稍大的酶切体积，以避免水分蒸发过多影响的酶切体系各组分浓度改变过大;置65℃水浴中10分钟，对限制性内切酶进行灭活，不同的酶灭活条件可能不同，请参照说明书进行;进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应的结果;反应体系：10×内切酶缓冲液2lDNA1-1.5g限制性内切酶2-5单位用灭菌的ddH2O补至20l，37℃1小时。可根据需要按比例放大。pGFPuv和pBSK的酶切体系：酶切体系质粒载体（pGFPuv和pBSK）10

6、×REbuffer(E)6l100×BSA0.6lDNA6gEcoRI0.6lHindIII0.6lddH2OXl→合计60l充分混匀后，用离心机短时（10秒）离心，于37℃保温3-4小时或过夜，65℃保温10分钟使限制性内切酶失活。五.注意事项酶的定义:在标准条件下,1小时完全消化1μg线型DNA分子所需的酶量定义为1U；影响限制性内切酶活性的生物因子：酶切割位点周围核苷酸两侧的碱基的性质；识别序列在DNA中的分布频率；与DNA的构象有关（SC,L,OC）；DNA的纯度（蛋白、氯仿、SDS、EDTA、甘油等）；影响限制性内切酶活性的生物因子：内切酶用量不超过总反应体积的1

7、0%；消化时间适当延长有利于提高酶活性；加DNAse-free的BSA可以起到稳定酶活性的作用；用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活性；酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可使用；DNA样品应不含重金属离子。六.DNA片段的胶回收电泳洗脱法低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法冻融回收法玻璃奶回收法柱回收法（按说明书进行）GelExtractionProtocol胶回收后用30-50μl无菌双蒸水洗脱DNA片段，取1-5μl进行电泳检测，取