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时间:2020-03-23
《实验:酶切、胶回收和连接.ppt》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、限制性内切核酸酶消化DNA、从琼脂糖凝胶中回收DNA及载体与目的基因的连接掌握限制性内切酶特异性切割DNA的原理与方法掌握DNA片段从琼脂糖凝胶中回收的原理与方法掌握如何构建体外重组DNA分子及DNA的连接方法实验目的限制性内切核酸酶消化DNA限制性内切核酸酶(restrictionenzyme)是一类识别DNA上特意核苷酸序列并产生切割反应的内切核酸酶(endonuclease)的总称。在基因操作中,这些酶作为“剪刀”对DNA起剪切作用,是分子生物学研究中不可缺少的酶之一。限制性内切酶能识别,结合双链DNA分子中
2、特异的核苷酸序列,并在该序列内部水解核苷酸之间的3,5-磷酸二酯键,切断DNA双链结构。限制性内切酶识别的DNA序列一般长度为4~6个核苷酸,具有回文结构(双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列)特征。限制性内切核酸酶消化产生的DNA末段分为5’粘性末端,平末端,3’粘性末端三大类。末端的5’端为磷酸基团(-P),3’端为羟基基团(-OH)。这些末端结构可能影响其它酶(如连接酶)的反应效率,应特别注意。原理在我们今天的实验中,用到两种限制性酶分别是HindⅢ和EcoRⅠ,这两种酶切割后产生的
3、片段都具有粘性末端,可以保证酶切产物与载体正确的连接。酶切体系10×M:2mlHindⅢ:1mlEcoRⅠ:1mlddH2O:6ml质粒:10ml总体积:20ml将酶切体系按顺序加好后放入已预热的37°C的水浴锅中,使反应体系在这个温度下进行酶切。酶切2h后加2ml10×loadingbuffer终止酶切反应,取全部的样品用于胶回收。试验中用到的两种酶的缓冲液HindⅢ:EcoRⅠ:MBufferHBuffer对于HindⅢ来说,在含有MBuffer时的酶切效率最高;而对于EcoRⅠ来说,在HBuffer里面的酶切
4、效率高;但在两者同时进行酶切时,在MBuffer里时的效率最高。因此本实验中我们用MBuffer来进行HindⅢ和EcoRⅠ的双酶切。从琼脂糖凝胶中回收DNA在酶切的过程中,除产生我们所需要的目的片段外,还会产生一些小片段,这些小片段可能会与载体连接,从而产生干扰,去除这些小片段的最好的方法就是进行琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖凝胶回收:原理:不同分子量的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳中由于泳动速度不一样而分离,通过回收可用于后续实验。NaI存在条件下,加热至55℃,含有DNA片段的琼脂糖凝胶就会融化,然后可利用硅胶树脂吸附D
5、NA分子,从而得到纯净的DNA片段。硅胶树脂在高盐离子浓度下可以高效专一的吸附DNA,通过离心可将DNA片段沉淀下来,在碱性低盐浓度下其与DNA的结合能力会急剧降低,使用弱碱溶液如TE(pH8.0)等可以从硅胶离心柱洗脱得到纯净的DNA片段。1.取一干净的1.5ml的离心管,称重,标记。2.紫外下用干净的手术刀切下含有目的片段的DNA凝胶,放入已称重的离心管中,称重。3.按每100mg琼脂糖凝胶加入400mlbindingsolution的量添加solution至装有凝胶的离心管中。50~60℃放5~10min融胶
6、。4.将以上溶液转移至Genclean柱中,室温放置2min,6000rpm室温离心1min。将离心下来的液体倒回Genclean柱中再重复离心一次。弃收集管中的废液。操作步骤5.往上述管中加入500mlwashsolution,12000rpm,1min,弃废液。6.重复步骤5一次。7.将Genclean柱放回收集管中,12000rpm,1min,彻底去除washsolution。8.将Genclean柱放到一干净的1.5ml的离心管中,加入30mlElutionbuffer,37℃放置2min,12000rpm
7、,1min.所得液体即目的片段。9.取5ml目的片段,加入1ml6×loadingbuffer,电泳鉴定。剩余液体可直接用于后续试验或-20℃保存。注意事项电泳所用的胶的浓度为1%,胶经冻融后,孔径较大,利于挤压。溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏,故尽量放置于暗室,切带时应使用长波长紫外灯,切胶时间尽量短。在切胶时,要注意尽量沿目的片段的边缘切下,使其所带的琼脂糖尽量少。这样琼脂糖不会影响后面的提纯。DNA的重组连接原理:DNA重组连接是通过将已经切开的载体和外源DNA,通过DNA连接酶催化两双链DNA片段组邻
8、的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸酯键,从而形成新的DNA。本实验利用T4DNA连接酶,有Mg2+,ATP存在的连接体系中,将载体pUC18与目的基因连接起来。连接体系DNA:7ml载体:1mlT4Buffer:1mlT4DNALigase:0.5mlddH2O:0.5ml总体积:10ml(所需要用到得酶及缓冲液均需冰浴,以防蛋白变性)
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