实验2 酶切 片段回收和连接

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1、酶切、片段回收与连接酶切、片段回收与连接黄华如（生命科学学院，生技091，29号）摘要：实验用bt2质粒和pet质粒做酶切材料，回收目的片段，经连接后，转入以氯化钙罚制备的大肠杆菌感受态细胞中，并让转化大肠杆菌在含有抗生素培养基上生长，最后用长出来的大肠杆菌做验证PCR。本次试验中，质粒经过双酶切后，可以清晰的看到目的条带，转化后的大肠杆菌也可以在含有抗生素培养基中长出来，但是最后的验证PCR验证在培养基上生长的是假阳性大肠杆菌。说明了实验中目的基因没有成功转入大肠杆菌。关键词：重组；酶切；连接；转化；片段回收基因文库的建立为重组DNA研究工

2、作提供了方便的、有意义的基因。构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。对于复杂的染色体DNA分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库。基因工程(geneengineering)是20世纪70年代以后兴起的一门新技术，即用人工的方法，把遗传物质DNA分离出来，在体外进行基因切割、连接、重组，然后再转移到生物体内并进行表达的技术。基因工程中的关键一步是将目的基因与DNA载体连接成重组DNA，获得重组子，并把重

3、组子筛选出来。近年来，建立了许多方法来筛选重组子，其中较为常用的是利用a互补原理，根据菌落的蓝白颜色进行筛选1oL一互补是指E．coliB一半乳糖苷酶的两个无活性片段(N端片段和c端片段)组合而成为功能完整的酶的过程。现在使用的许多质粒载体都带有一个E．coliDNA的短片段，其中含有B．半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码信息及调控序列。在这个编码区中插入了一个多克隆位点，可在此处插入外源DNA片段。这种类型的载体适用于可编码B．半乳糖苷酶c端部分的宿主细胞。尽管宿主和载体编码的两个片段都没有活性，但他们能够融合为具有酶活性的蛋白质，在含有底

4、物X-gal的培养基中形成蓝色菌落。当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，导致N端片段丧失仪．互补能力，因此，带有重组质粒的宿主细胞将形成白色菌落[1]。1材料与设备1.1试供材料大肠杆菌、质粒DNA1.2试剂准备质粒DNA回收试剂盒、灭菌水、琼脂糖、BamHI、HindIII、T4连接酶、T4Buffer、LB固体培养基、等1.3实验设备及用具高速冷冻离心机、液氮罐、恒温水浴锅、紫外分光光度计、制冰机、冰箱、移液枪、PH计、冰盒、恒温培养箱、恒温振荡摇床、高压灭菌锅、恒温水浴锅等。2实验步骤2.1提取质粒DNA这个步骤由老师完成2.2酶

5、切第5页酶切、片段回收与连接表一：质粒（bt2）双酶切体系表二：质粒（pet）双酶切体系试剂用量试剂用量Buffer2ulBuffer2ul质粒（bt2）4ul质粒（pet）4ulBam1HI1ulBam1HI1ulHindIII1ulHindIII1ulWater12ulWater12ul总体系20ul总体系20ul酶切2h以上，酶切结束后，用1.2%琼脂糖检查双酶切效果。2.3片段回收1)使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。2)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。

6、此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。胶块超过300mg时，请使用多个Column进行回收，否则严重影响收率。注）切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。3)切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。4)称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1ul进行计算。5)向凝胶中加入胶块融化液BufferGM，BufferGM的加量如下表：凝胶浓度BufferGM使用量1.0%3个凝胶体积量1.0%-1.5%4个凝胶体积量1.5%-2.0%

7、5个凝胶体积量6)均匀混合后室温15-25℃融化凝胶。此时应间断震荡混合，是胶块融化（约5-10分钟）。7)当凝胶完全融化后，观察融胶液的颜色，如果融胶液颜色有黄色变为橙色或粉色，向上述胶块融化液中加入10ul3M醋酸钠溶液（pH5.2），均匀混合至溶液恢复黄色。当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。8)将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。9)将上述操作步骤7的溶液转移至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。10)将700ul的BufferWB加

8、入SpinColumn中，室温12,000rpm离心30秒钟，弃滤液。11)重复操作步骤10。12)将SpinColumn安置于CollectionTube上，室温