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时间:2019-05-07
《dna-重组-酶切和连接》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、Q&A关于质粒提取结果的分析预实验结果载体(3.65kb)123PETBlue质粒DNA的琼脂糖电泳(1%)Lane1:sample1Lane2:sample2Lane3:sample3一条带杂带预实验结果PETBlue质粒DNA的琼脂糖电泳(1%)Lane1:sample1Lane2:sample2Lane3:sample3两条带三条带DNA分子的大小琼脂糖浓度DNA分子构象染色剂的量电压缓冲液的组成缓冲液离子强度等等……分子克隆上册,第五章一条带123我们的结果PETBlue质粒DNA的琼脂糖电泳(1%)Lane
2、1:Marker;Lane2:sample1;Lane3:sample2;Lane4:sample31215000bp10000bp7500bp5000bp2500bp1000bp250bp34我们的结果质优量少,成功率低质优量足卫星菌落??我们的结果???电泳行为异常???我们的结果可用电泳:尽量减少上样时间,减少扩散;样品尽量均匀分布于胶孔中;尽量远离边缘泳道Q&A关于实验中的安全问题关于酚-氯仿-异戊醇分层问题:下层作用问题:酚变性蛋白氯仿去除脂类,除酚异戊醇消泡,减少表面张力剪切关于酚:下层;氧化判断
3、基因重组-酶切和连接基因的克隆与表达专题之三剪切5’NNGOHpGATCCNN3’3’NNCCTAGpHOGNN5’BamHⅠHindⅢ+引物15’GTCGCGGATCCGATGTCACGGCCGAGAC3’CDS5’AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT…………………………………………………………………………….………………………………………AKPCDS………………………………….……………………………………………………………………………….………………………………………
4、……………………………………….CDS….CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3’引物23’GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG5’BamH1HindⅢpETBlue-2ATGGCGATATCCCGGGAGCTCGTGGATCCGAAT引物1:5’GTCGCGGATCCGATGTCACGGCCGAGAC3’BamHⅠ引物2:5’GCGACAAGCTTTATTTCAGCCCCAGAGC3’HindⅢ5’pApCpGoHpApApTpTpCpGpT3’3’Tp
5、GpCpTpTpApApoHGpCpAp5’5’pApCpGpApApTpTpCpGpT3’3’TpGpCpTpTpApApGpCpAp5’Mg2+ATPT4DNA连接酶连接pETBlue-23.653kb酶切连接酶切pETBlue-AKP(5.2kb)pETBlue-23.653kb转化复苏pETBlue-AKP-AKPpETBlue-pETBlueAKP√酶切:370C,水浴酶切3小时(封口膜封口)酶切产物的纯化和盒回收:直接进行液体回收:每100uL溶液加入500uL溶胶液,其余的操作步骤同前。向柱子的正中央共
6、加20uL洗脱buffer,其余步骤同前。酶切反应体系管号核酸10xbufferKddH2OBamHIHandIIItube1目的基因AKP24uL3uL0uL2uL1uLtube2pETBlue-210uL2uL5uL2uL1uL实验操作-酶切每人做一至两份胶回收原理硅基质材料:小片段双链DNA高盐环境与其吸附低盐环境与其解离每100uL溶液加入500uL溶胶液,混匀。将液体转移至吸附柱,12000rpm离心30秒,去除废液漂洗:向吸附柱的正中央加入500uL漂洗液,12000rpm离心30秒,去除废液。重复一次。
7、空柱12000rpm离心2min,以彻底去除废液将吸附柱置于一新的干净无菌的1.5mLEP管中,向吸附柱的正中央加15uL无菌水,室温放置5分钟。12000rpm离心30秒,以洗脱DNA。再次向柱子的正中央加5uL无菌水,室温放置5分钟;12000rpm离心2分钟。合并回收液。SYBR检测回收产物避免乙醇对酶促反应的影响1%琼脂糖凝胶25mL(用1xTAE配)1uLGoldView样品:酶切DNA4uL+0.5uL10xloading质粒对照:未酶切质粒DNA2uL+0.5uL10xloading分子量Marker:
8、5uL80伏恒压电泳,结果凝胶成像分析注意:Marker上5uL时大概的量是50ng/条带上样精准上样顺序(对照)实验操作-酶切电泳分析*PV0V1V1’M2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp连接反应体系(20uL)目的基因AKP载体pETBlue-210xLigasebufferddH2OT4DNA连接酶XuLYu
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