实验七质粒酶切及连接.ppt

《实验七质粒酶切及连接.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、实验七质粒酶切及连接DNA重组技术的基本过程分一基切本原理接转→筛1.分：分离出要克隆的目的基因及载体。目的基因的分离：Ø直接分离DNA—适用于克隆原核生物的基因组文库Ø构建基因组文库，筛选目的基因Ø构建cDNA文库，筛选目的基因ØPCR扩增目的基因片段Ø人工合成较短的DNA片段载体的分离2.切：用限制性内切酶切割目的基因和载体，使其产生便于连接的末端。定义：限制性内切酶是指一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。来源：细菌和真菌功能：以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3

2、′端为OH。Ø命名：酶来源的生物名称缩写属名-种名-株名-发现次序Ø分类：限制性核酸内切酶根据识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性分为三大类。特性I型II型III型限制和修饰活性双功能酶核酸内切酶和甲双功能酶基化酶分开限制作用所需辅助因ATP、Mg2+Mg2+ATP、Mg2+子特异性识别位点非对称序列回文对称结构非对称序列切割位点距识别位点1000位于识别位点上距识别位点下游bp处随机切割24-26bp处序列特异的切割不是是是在基因工程的应用用处不大广泛使用用处不大ØⅡ型限制性核酸内切酶的特点及作用特性

3、•Ⅱ型酶限制修饰系统分别由限制酶和修饰酶两种不同的酶组成。•它的分子量小，仅需Mg2＋做辅助因子，它们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割。•识别顺序一般为4－6个碱基对，识别顺序具有180度的旋转对称性，具有回文结构。5’-CTGCAG-3’5’-GTTAAC-3’3’-GACGTC-5’3’-CAATTG-5ØⅡ型酶切割双链DNA产生2种不同切口l平末端：在识别顺序的对称轴上，对DNA同时切割形成平末端，如：SmaI5’－CCCGGG－3’5’－CCCGGG－3’3’－GGGCCC－5’3’

4、－GGGCCC－5’l粘末端：•5′突出粘末端：在识别序列的两侧末端切割DNA双链，于对称轴的5′末端切割产生5′端突出的粘性末端，如：HindIII5’－AGCTT－3’5’－AAGCTT－3’5’－AA－5’3’－TTCGAA－5’3’－TTCGA－5’•3′突出粘末端:与5′突出粘末端作用相反，产生3′端突出粘末端，如：PstI5’－CTGCAG－3’5’－CTGCA－3’G－3’3’－GACGTC－5’3’－G3’－ACGTC－5’Ø限制性核酸内切酶的单位在适当的条件下（T，pH，离子强度等）一小时内

5、完全酶解1μg特定DNA底物所需要的限制性核酸内切酶的量，定义为1个活性单位。目前常用的酶单位的定义是：37℃，1小时内50ul反应体系完全酶解1μgλDNA所需的酶量。在建立酶切体系时，酶的用量一般为1－5U/μgDNAØ影响酶切的因素üDNA限制性内切酶ü酶作用底物（DNA纯度）ü反应缓冲液ü盐离子浓度ü酶解温度与时间üDNA限制性内切酶1.内切酶的识别位点及形成的粘性末端；2.内切酶体积不能超过反应体系10%，因内切酶中含50%甘油作为保护剂，甘油浓度过高会影响酶切反应；3.操作应在低温下进行（冰上）。

6、ü酶作用底物DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、乙醇等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。ü反应缓冲液酶切缓冲液成分及作用：①Tris-HCl，维持pH在7.4－8.0；②Mg2+，内切酶活性所必需；③NaCl/KCl，增加离子浓度，利于酶活性；④二硫苏糖醇(DTT)，保护酶，防止二硫键的形成不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。ü盐离子浓度Ø不同的限制性内切酶对盐离子强度（Na+）有不同的要求.一般按离子强度不同分为低（10mmol/L）、中（50mmol/L

7、）、高盐（100mmol/L）三类。ØMg2+是酶切反应必需的。ü酶解温度与时间Ø温度：大多数限制酶反应温度为37℃，也有的酶需在50℃或其他温度下进行反应。Ø时间：一般1-2小时即可，进行大量DNA酶解反应时，可酶解过夜。l星号活力限制性核酸内切酶在非标准反应条件下，能够切割一些与其特异识别顺序类似的序列，这种现象称为星号活力。星号活力出现的原因：•酶用量太大>100U/ugDNA•酶切体系中离子强度太低，<25mM正常为100－150mM•甘油浓度过高>10％（V/V）EcoRI•反应体系pH值过高>8P

8、stI•一般反应体系的pH为7.0左右•反应体系中存在有机溶剂，如乙醇，DMSO等•有与Mg竞争的其它二价阳离子，如Mn离子Ø内切酶解时注意事项•限制性内切酶需低温保存•酶切反应时最后加酶•更换吸头，避免污染•注意酶的加入量•酶解温度及时间的控制•加完酶后要在离心机上“甩”一下，混匀本实验中的质粒lpBR322---作为目的基因供体lpUC18---作为载体实验步骤1.用HindⅢ酶切：提取的质粒(