实验五 质粒酶切及电泳检测.ppt

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1、质粒酶切及电泳检测实验四一般提取的质粒有3种构型：超螺旋的共价闭合环状，开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，线状质粒DNA，即质粒DNA在同一处两条链都发生断裂。通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。酶切示意图限制性内切酶1.定义：识别双链DNA分子核苷酸序列并加以切开2.来源：细菌的限制修饰系统3.特性：识别4~6个核苷酸序列产生平端和粘端4.应用：定点切割限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：Ⅰ型Ⅱ

2、型*（回文对称顺序）Ⅲ型粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为：5’……G’AA

3、TT_C……3’3’……C_TT

4、AA’G……5’垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。_和‘表示在双链上交错切割的位置，切割后生成5’……G和AATTC……3’、3’……CTTAA和G……5’二个DNA片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而

5、“粘合”。平头末端：II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV的识别位置是：5’……GAT’

6、ATC……3’3’……CTA’

7、TAG……5’切割后形成5’……GAT和ATC……3’、3’……CTA和TAG……5’。这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。限制性核酸内切酶的命名法第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。EcoRⅠ属种株序EscherichiacoliRY13株大肠杆菌RY13株的第一种酶影响核酸限制性内切

8、酶活性的因素DNA的纯度；DNA的甲基化程度；酶切消化反应的温度；DNA的分子结构；溶液中离子浓度及种类；缓冲液的pH值。NheI5'...G↓CTAGC...3'3'...CGATC↑G...5'酶活性的定义：一个活性单位（U)，是指在50l反应体系中，37oC的条件下，经过1小时的反应时间，将1gDNA完全酶解所需要的酶量。实验原理利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位点，定点切割环状质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实验方法，它能检测少量的DNA（如用肉眼观察，可检测到10ng的DNA），且检测的范围很广。酶切反应限制

9、性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。20μl体积反应体系如下：A:质粒（pEGFP-N1）0.5μgB:10×酶切buffer2.0μlC:限制性内切酶NheI0.5μlD:加ddH2O至20μl37℃水浴消化1小时。质粒的酶切电泳质粒酶切图谱M:DNAMarker;1：重组质粒；2：线形质粒；3：环形质粒注意事项购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快

10、，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。ODng/μl<0.5μgddH2OX1.7931263.9μl13.6μl张1.8051114.5μl13.0μl31.7861672.9μl14.6μl41.7991303.8μl13.7μl51.7881064.7μl12.8μl71.8001403.5μl14.0μl81.79072.56.8μl10.7

11、μl101.80081.06.1μl11.4μl141.8041293.8μl13.7μl151.8001263.9μl13.6μl161.7901114.5μl13.0μl211.7931782.8μl14.7μl思考题：质粒的存在有几种形式？酶切有哪些注意事项？