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时间:2018-07-25
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1、实验一质粒提取、酶切及琼脂糖电泳检测一、实验内容1.采用碱裂解法提取质粒DNA2.采用限制性内切酶对质粒进行酶切3.采用琼脂糖电泳对所提取的质粒DNA及其酶切产物进行鉴定二、实验目的和要求1.掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法2.掌握限制性内切酶酶切DNA的操作过程3.掌握琼脂糖电泳的原理和方法三、实验仪器、材料和试剂1.仪器:摇床、无菌操作台、离心机、电泳仪、凝胶成像仪等2.材料:移液枪、枪头、离心管、三角烧瓶等3.试剂:LB培养基,卡那霉素,质粒提取试剂盒,琼脂糖,电泳缓冲液TAE,核酸染料,DNAMarker(DL2000,λ-HindIIId
2、igestDNAMarker),EcoRI内切酶等。四、实验操作1.质粒提取(1)挑取单菌落至3mLLB液体培养基,37℃摇动(200rpm)培养过夜。(2)转移菌液至1.5mLEppendorf管中,12000rpm离心45sec,尽量弃尽上清。(3)加入250ml预冷的PI(请先检查是否加入RNaseA),使用移液器彻底混匀细菌沉淀,充分悬浮,静置2min。注意:如果有未彻底悬浮的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度的偏低。(4)向离心管中加入250ul溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意:温和地混合,不要剧烈振荡,以免打断基因组DNA
3、,造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。此时菌液应变得清亮粘稠,所用时间不应超过5min,以免质粒收到破坏。如果未变得清亮,可能菌体过多,裂解得不彻底,应减少菌体量。(5)向离心管中加入350ul溶液P3,立即温和地上下翻转6-8次,充分混匀,此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心1min,此时在离心管底部形成沉淀。注意:P3加入后应立即混合,避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小的白色沉淀,可再次离心后取上清。(6)向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500ul的平衡液BL,12,000rpm离心1min,倒掉收集管中废液,将吸附管重新放入
4、收集管中。(请用当天处理过的柱子)(7)将步骤(5)获得的上清液用移液管转移到吸附柱CP3中(将吸附柱放入收集管中),注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中。(8)向吸附柱CP3中加入500ul去蛋白液PD,12,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。(9)向吸附柱CP3中加入600ul漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)12,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。(10)重复操作步骤(9)(11)将吸附柱CP3放入收集管中,12
5、,000rpm离心2min,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。注意:漂洗液中的乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)。为了确保下游试验不受残留乙醇的影响,建议打开吸附柱CP3的盖子,置于室温下放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。(12)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中,向吸附膜中间部位滴加50-100ul洗脱液EB,室温放置2min,12,000rpm离心2min,将质粒溶液收集到离心管中(12)利用分光光度计对提取的pGEX-4-T质粒DNA进行定量测定。(13)取3µL提取的质粒DNA,利用琼脂糖凝胶电泳检测。(14)-20℃保
6、存。2.质粒酶切按以下酶切反应体系酶切质粒pET-28a:10×HBuffer2µLddH2O7µLEcoRI1µLpET-28a10µL(≤1µg)Total20µL酶切反应条件:37℃下酶切1h,用1%琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果。3.琼脂糖电泳(1)配制1%琼脂糖凝胶:称取0.3g琼脂糖,置于试剂瓶中,加入30mL0.5×TAE工作液,将该试剂瓶置于微波炉加热直至琼脂溶解。(2)胶板的制备:将有机玻璃内槽洗净,晾干,放入制胶模具中,并在固定位置插上梳子,将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液倒入30mL于小烧杯中,加入1.2μL的核酸染料(Goldvie
7、w),轻轻摇匀,小心地倒在有机玻璃内槽上,使胶液慢慢展开,直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下放置30min左右,凝固完全后,轻轻拔出梳子,这时在胶板上刚形成相互隔开的上样孔。待用时,将铺好胶的有机玻璃内槽放入含有电泳缓冲液TAE的电泳槽中备用。(3)加样:将样品4ul与上样液(6X)1ul混合后,用微量加样器将上述样品加入胶板的样品孔内。每加完一个样品,换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面,样品孔容量约为10mL左右。(4)电泳:加完样后的凝胶板可以通电进行电泳。建议在80-100V的电压或20mA下电泳。当溴酚蓝移动到距离胶板下
8、沿约1.5cm时,停止电泳。(5)染色、观察和拍照:在紫外灯下观察凝胶。DNA存
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