实验一 质粒提取、酶切及琼脂糖电泳检测

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1、实验一质粒提取、酶切及琼脂糖电泳检测一、实验内容1.采用碱裂解法提取质粒DNA2.采用限制性内切酶对质粒进行酶切3.采用琼脂糖电泳对所提取的质粒DNA及其酶切产物进行鉴定二、实验目的和要求1.掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法2.掌握限制性内切酶酶切DNA的操作过程3.掌握琼脂糖电泳的原理和方法三、实验仪器、材料和试剂1.仪器：摇床、无菌操作台、离心机、电泳仪、凝胶成像仪等2.材料：移液枪、枪头、离心管、三角烧瓶等3.试剂：LB培养基，卡那霉素，质粒提取试剂盒，琼脂糖，电泳缓冲液TAE,核酸染料，DNAMarker(DL2000，λ-HindIIId

2、igestDNAMarker),EcoRI内切酶等。四、实验操作1.质粒提取（1）挑取单菌落至3mLLB液体培养基，37℃摇动（200rpm）培养过夜。（2）转移菌液至1.5mLEppendorf管中，12000rpm离心45sec，尽量弃尽上清。（3）加入250ml预冷的PI(请先检查是否加入RNaseA)，使用移液器彻底混匀细菌沉淀，充分悬浮，静置2min。注意：如果有未彻底悬浮的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度的偏低。（4）向离心管中加入250ul溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈振荡，以免打断基因组DNA

3、，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒收到破坏。如果未变得清亮，可能菌体过多，裂解得不彻底，应减少菌体量。（5）向离心管中加入350ul溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心1min，此时在离心管底部形成沉淀。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小的白色沉淀，可再次离心后取上清。（6）向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500ul的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附管重新放入

4、收集管中。（请用当天处理过的柱子）（7）将步骤（5）获得的上清液用移液管转移到吸附柱CP3中（将吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。（8）向吸附柱CP3中加入500ul去蛋白液PD，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。（9）向吸附柱CP3中加入600ul漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇）12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。（10）重复操作步骤（9）（11）将吸附柱CP3放入收集管中，12

5、,000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。注意：漂洗液中的乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）。为了确保下游试验不受残留乙醇的影响，建议打开吸附柱CP3的盖子，置于室温下放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。（12）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位滴加50-100ul洗脱液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中（12）利用分光光度计对提取的pGEX-4-T质粒DNA进行定量测定。（13）取3µL提取的质粒DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测。（14）-20℃保

6、存。2.质粒酶切按以下酶切反应体系酶切质粒pET-28a：10×HBuffer2µLddH2O7µLEcoRI1µLpET-28a10µL（≤1µg）Total20µL酶切反应条件：37℃下酶切1h，用1%琼脂糖凝胶电泳检测双酶切结果。3.琼脂糖电泳（1）配制1%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖,置于试剂瓶中，加入30mL0.5×TAE工作液，将该试剂瓶置于微波炉加热直至琼脂溶解。（2）胶板的制备：将有机玻璃内槽洗净，晾干，放入制胶模具中，并在固定位置插上梳子，将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液倒入30mL于小烧杯中，加入1.2μL的核酸染料（Goldvie

7、w），轻轻摇匀，小心地倒在有机玻璃内槽上，使胶液慢慢展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下放置30min左右，凝固完全后，轻轻拔出梳子，这时在胶板上刚形成相互隔开的上样孔。待用时，将铺好胶的有机玻璃内槽放入含有电泳缓冲液TAE的电泳槽中备用。（3）加样：将样品4ul与上样液（6X）1ul混合后，用微量加样器将上述样品加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面，样品孔容量约为10mL左右。（4）电泳：加完样后的凝胶板可以通电进行电泳。建议在80-100V的电压或20mA下电泳。当溴酚蓝移动到距离胶板下

8、沿约1.5cm时，停止电泳。（5）染色、观察和拍照：在紫外灯下观察凝胶。DNA存