实验六质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测

《实验六质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、实验一质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测(高纯质粒小量制备试剂盒方法,百泰克)实验目的实验原理实验仪器、材料与试剂实验步骤实验结果及讨论一、实验目的了解高纯质粒小量制备试剂盒和碱法提取质粒的原理掌握百泰克高纯质粒小量制备试剂盒方法提取质粒的方法二、实验原理(百泰克高纯质粒小量制备试剂盒方法)本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。一、原理简介本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除

2、，最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。实验原理（碱法）质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色

3、体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。载体结构的三大要素：多克隆位点选择标记（耐药性，LacZ）独立的复制单位载体种类：质粒噬菌体酵母人工染色体（YAC）反转录病毒载体表达载体等pBCSKmap三、实验仪器、材料与试剂（一）仪器恒温摇床超净工作台高压灭菌锅高速台式离心机微量取液器、1.5mLEP管LB液体和固体培养基卷纸、无水乙醇、双蒸水（二）材料和试剂含pUM-T(pMD18-T或KS，pRT101)质粒的大肠杆菌DH10B（

4、DH5α或HB101）。含外源基因的重组pUM-T(pMD18-T或KS，pRT101)质粒的大肠杆菌DH10B（DH5α或HB101）。氨苄青霉素（Amp）：用无菌水配制成50-100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存备用。pMD18-TVectorLB液体培养基（1L）：胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g。加去离子水至800ml搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20分钟。5.LB固体培养基（1L）：在上述LB液体培养基（1L）中

5、加入琼脂粉(Agar)15g。四、实验步骤百泰克高纯质粒小量制备试剂盒第一次使用前请先在15ml(25ml)漂洗液WB中加入45ml(75ml)无水乙醇!将RNaseA全部加入溶液P1中，混匀，每次使用后置于2-8℃保存。取1.5-4.5毫升过夜培养的菌液，9000rpm，离心30秒，弃上清，收集菌体，尽可能的倒干上清。处理超过1.5毫升菌液可以离心去上清后，在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。2.用250μl溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。如果有未彻底混

6、匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。3.加250μl的溶液P2，温和的上下翻转6-10次使菌体充分裂解，直到溶液变得清亮。温和的混匀，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步。4.加400μl溶液P3，立即温和的上下翻转6-10次，室温放置5分钟。室温13，000rpm离心10分钟，小心取上清。5.(将吸附柱安置于收集管上，加入500μl溶液P4，室温13,000rpm离心1分钟，弃滤液；)

7、将上一步所得上清液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），13,000rpm离心1分钟，弃滤液。6.加入500μl去蛋白液PE，13,000rpm离心30-60秒，弃滤液。此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质，如所用菌株为JM系列、HB101等，因为核酸酶含量丰富，应加此步骤；如所用菌株为XL-1Blue和DH5α等，核酸酶含量低，则可忽略此步骤。加入500μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇！），13,000rpm离心30-60秒，弃滤液。重复步骤7一次，13,000rpm离心30-60秒，弃滤液。

8、空柱13,000rpm离心2分钟。室温放置3-5分钟，除去残留乙醇。9.取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加60-100μl洗脱缓冲液EB或双蒸水（洗脱缓冲液事先在65℃-70℃水浴中加热效果更好）,室温放置1分钟，13,000rpm离心1分钟洗脱质粒DNA，可立即用于下游分子生物学实验或-20℃保存。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小不应少于50μl，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质