实验二质粒的酶切和琼脂糖凝胶电泳检测.ppt

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1、实验二质粒的酶切和琼脂糖凝胶电泳检测实验二质粒的酶切和琼脂糖凝胶电泳检测实验目的实验原理实验仪器、材料与试剂实验步骤实验结果及讨论一、实验目的限制性内切酶切割出目的DNA了解琼脂糖凝胶电泳的原理掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法二、实验原理利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位点，定点切割环状质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实验方法，它能检测少量的DNA（如用肉眼观察，可检测到10ng的DNA），且检测的范围很广。琼脂糖凝胶电泳对DNA分子的检测，主要基于在凝胶中加入溴化乙锭，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光，而在紫外

2、光下DNA发出的荧光是可见光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，因而DNA的检测很方便。如将已知大小和浓度的标准样品（Marker）作电泳对照，就可估计出待测样品的大小和浓度。三、实验仪器、材料与试剂仪器1.水平式凝胶电泳槽2.稳压电泳仪3.电炉4.紫外检测仪5.台式离心机材料实验一中提取的质粒DNA和本实验酶切后的质粒DNA。试剂1.限制性内切酶EcoRI，HindIII(XholI)2.50×TAE电泳缓冲液（pH8.0）:Tris242g冰醋酸57.1ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）100ml稀释到电泳缓冲液1×TAE3.溴化乙锭溶液:10mg/ml

3、水溶液，室温，棕色瓶或铝铂纸包装保存。4.10×(6×)×DNA样品上样缓冲液(LoadingBuffer,溴酚蓝指示剂,DNA样品加样缓冲液)5.琼脂糖Agarose四、实验步骤在20μL反应体系中，包括：质粒KS16μLEcoRI1μLXholI1μLBufferH2μLddH2O0μL37℃酶切1.5~2.0小时。或在20μL反应体系中，包括：质粒pMD18-T16μLEcoRI1μLHindIII1μLBufferM2μLddH2O0μL37℃酶切1.5~2.0小时。注：双酶切体系。最初我们PCR使用的PMD18-T(KS)载体特点：600bp外源基因片段的两端分别被EcoRI

4、和HindIII(XhoI)酶切，插入PMD18-T(KS)载体MCS多克隆位点，因而可进行EcoRI和HindIII(XhoI)双酶切验证。双酶切得到的小的外源片段大小应是600bp左右。pMD18-TVectorpBCSKmap琼脂糖凝胶制备步骤1.洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干；2.插好挡板、梳子；3.配制1%的Agrose琼脂糖凝胶液：根据实验所需称取0.4克琼脂糖，放入制胶的容器中（一般用三角瓶），然后加入40ml电泳缓冲液（1×TAE）；4.加热煮沸，使琼脂糖完全溶解；5.待Agrose琼脂糖凝胶液稍凉（约55℃左右，不烫手）后，加入约1/1000的1mg/ml溴化乙

5、锭溶液（约4μL至终浓度为0.5-1μg/ml）后轻轻混匀，倒入制胶槽上，勿起气泡（避免剧烈摇晃产生气泡）；6.室温下约30分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将凝胶放入电泳槽中；7.加入电泳缓冲液（1×TAE）至电泳槽中，使液面高于胶面约1mm；8.在DNA样品中加入2μL(1/10体积)的10×DNA上样缓冲液(loadingbuffer)，混匀，稍甩一下，使溶液都处于离心管底；使用3mg的DNAMarkerDL2,000（500ng/条带）进行1%的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp

6、。9.用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中；10.插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节电压至100V，电泳开始，观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现；11.等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电流）回零，关闭电源，停止电泳；12.取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果；13.根据需要切下DNA条带，放入1.5mlEp管中，放于4℃保存，以备下周实验用。五、实验结果及讨论质粒DNA在琼脂糖凝胶中一般为三条带，最前面的条带为超螺旋构型，中间为线型，最后为单链有缺刻的构型。如提取过程中有机械损伤，可能在胶上出现弥散。影响RE活性的主要因素：DNA的纯度；DNA的甲基化程度；

7、温度；缓冲液成分（DDT，BSA）等。