04 实验四 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳.ppt

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1、实验四DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳EcoRIRestrictionEnzyme识别序列------G↓AATTC------------CTTAA↓G------实验原理---限制性内切酶及酶切反应BamHIRestrictionEnzyme识别序列：------G↓GATCC------------CCTAG↓G------HindIIIRestrictionEnzyme识别序列：------A↓AGCTT------------TTCGA↓A------每一种限制性内切酶都有特定的反应条件：pH范围：7.5~8.0缓冲液组份:Tris(三羟甲基氨基甲烷）、NaCl、

2、MgCl2、温育温度：37℃反应体系：DNA(1ug或更少)5ul10xBuffer2ulRestrictionEnzyme3ulH2O10ulTotal20ul混匀，37度保温30分钟实验原理---琼脂糖凝胶电泳电泳是在一个电场的作用下，在琼脂糖支持介质上，能将一个混合物分离成若干条区带（若干个组分）的过程。琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。琼脂糖琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.

3、80.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2电泳法的优点凡是能带电的物质，都可以用电泳法分离。样品用量少。设备简单。可在室温进行。操作简便，费时不多不同类型的电泳，有不同的用途。改进或找到更好的支持介质，就有可能大大地提高分辩率。1、TAE电泳缓冲液Tris-base冰醋酸EDTA2、琼脂糖凝胶（0.8%）琼脂糖：0.8gTAE：100ml试剂3、溴化乙锭(ethidiumbromide，EB)EB染色液工作液浓度：0.01~0.03mg/mlEB是一种荧光染料，其扁平分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。4、6x

4、LoadingDye组成0.25%bromophenolblue（深蓝色）0.4%orangeG（黄色）10mol/LTirs-HCl(pH7.5),50mol/LEDTA使用量5份DNA样品溶液加1份Blue/6xLoadingDye操作步骤一、酶切反应反应体系：λ－DNA5ul10xBuffer2ulHindIII3ulH2O10ulTotal20ul混匀，37度保温30分钟二、电泳。1、电泳前的准备工作轻轻刷干净电泳制胶的梳子，模板，电泳槽，用蒸馏水洗净晾干，把制胶槽放入模板中。2、制胶(1)每组称取琼脂糖0.24g,倒入三角瓶，再往其中加入30ml电泳缓冲液，微波炉

5、加热直到琼脂糖溶化。（2)每组将琼脂糖液冷却到约70℃,轻轻倒入胶槽，并插上梳子。凝固约30min.(3)取出梳子，把胶放在电泳槽中，准备电泳。3、点样和电泳987654321987654321(1)将酶切产物、自制DNA与6xLoadingDye混合，每个样品混合后体积均为24ul。a.自制DNA20ul+4ulLoadingDyeb.酶切产物20ul+4ulLoadingDye(2)将标准λDNA/HandIII、λDNA、酶切产物、自制DNA各10ul点入点样孔。(3)电泳。(4)EB染色10min。（注意不要污染实验室环境）λ-DNA/HindIIIMarke

6、rs片段大小（bp）和电泳带型示意图点样孔23130941665574361232220274、紫外分析仪下看胶2313023222027941665574361警告胶染色和观察时一定要带手套！！！EB（溴化乙锭）诱变！！！结果记录与分析绘制电泳图谱