实验6+DNA酶切、连接及电泳检测.ppt

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1、实验结果分析关于OD值分析一个OD260nm单位相当于于50ug/ml双链DNA或40ug/ml单链DNA或RNAOD260/280:1.8-2.0DNA:1.8(RNA:2.0)比值<1.8：蛋白质污染比值>2.0:RNA污染质粒在正常情况下以共价闭合环状cccDNA构型(超螺旋scDNA)存在，在提取过程中由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能会使DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状/超螺旋DNA(cccDNA)；开环DNA(ocDNA）；线形DNA(LDNA)质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图关于电泳条带质

2、粒DNA的带型分析MpUC19环形质粒DNA超螺旋粒DNA出现问题电泳条带浓度和纯度电泳条带拖尾现象（加样过多，离子浓度，胶未完全凝固）质粒DNA的带型分析实验六DNA的酶切、连接及电泳检测实验步骤（一）质粒DNA酶切(注：每人一管）在200μl的薄壁离心管中，按照下表加入试剂（单位：μl）↓混匀；点动离心将反应液甩至管底。37℃(PCR仪)保温1-2h进行酶切反应。↓反应结束后，75℃，保温10min使酶失活。↓电泳检测样品代号成份反应1（标准pUC19)ddH2O无菌水(μl)7pUC19质粒(μl)1010*H酶切缓冲液(μl)2EEco

3、RI酶(μl)1.0Total(μl)20酶切样品代号成份反应（标准pUC19)ddH2O无菌水(μl)7pUC19质粒(μl)1010*H酶切缓冲液(μl)2EEcoRI酶(μl)1.0Total(μl)20（二）DNA片段的连接(注：每人一管）取200μl的离心管按下表加入试剂。↓混匀后点动离心，将溶液甩至管底↓置于已调好温度为12℃-16℃PCR仪中↓保温1-2h后取出↓电泳检测样品代号成分用量（μl）ddH2OddH2O7.0T14λDNA/EcoT14I片段10.010*T4连接缓冲液2.0T4T4DNA连接酶1.0总体积20连接样品

4、代号成分用量（μl）HddH2O7.0T14λDNA/EcoT14I片段10.0Buffer连接缓冲液2.0T4T4DNA连接酶1.0总体积20（三）质粒酶切样品和DNA连接样品的电泳检测琼脂糖凝胶的制备：制备2块0.7%（0.28g/40ml）和2块1.2%琼脂糖凝胶（0.48g/40ml）。（注：全班制备4块胶）1、掌握限制性内切酶的特性及酶切体系的建立；2、了解影响酶切的因素；3、掌握DNA连接酶的性质以及连接体系的建立；4、了解影响连接反应的因素。实验目的通过DNA重组技术构建DNA重组子利用限制性核酸内切酶切割DNA+利用DNA连接酶

5、连接DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一。成功的酶切和有效的连接为后续的外源基因进入宿主细胞进行表达提供了有效的实验材料。限制性内切酶的发现1965年WernerArber第一个描述了限制性内切现象；HamiltonO.Smith第一个纯化了限制性内切酶，并鉴定了其性质；DanielNathans用这些酶将SV40病毒的DNA切割成了特定的片段，并绘制了SV40病毒基因组的“物理图谱”。1978年这三人获得了当年的Nobel奖。ArberW.SmithH.O.NathansD.第一个DNA重组分子1972年PaulBerg等人利用限制性内切酶

6、EcoRI和连接酶获得了第一个DNA重组分子。标志着遗传工程的开始。TheNobelPrizeinChemistry1980PaulBerg通过DNA重组技术构建DNA重组子酶切连接实验原理–酶切限制性内切酶（restrictionendonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，

7、但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修饰酶活性，可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三类。DNA重组技术中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。Ⅲ型切割位点则在下游24-26bp处。Ⅰ类需Mg2+、SAM及ATP识别位点复杂，特异性差，切割位点距识别点远。Ⅱ类仅需Mg2+识别切割特异性强

8、，切割发生在识别位点。Ⅲ类需Mg2+及ATP切割位点在识别位点周围，酶活性不单一。命名一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母