质料的酶切与电泳检测

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1、质粒的酶切及电泳核酸的凝胶电泳电泳：带电粒子在电场中的涌动现象丙烯酰胺凝胶电泳5bp—500bp（分辨率高，1bp)琼脂糖凝胶电泳200bp—50kb（分离范围广、方便）琼脂糖介质结构均一，含水量大（98-99%），可通过调整琼脂糖的浓度改变孔径的大小，起到分子筛的作用核酸为两性分子，在pH3.5时，碱基上的氨基解离而磷酸基团中只有第一个磷酸解离，整个分子带正电；pH8左右时，碱基几乎不解离，而磷酸全部解离，整个分子带负电胶浓度（%）线性DNA分离范围（kb)0.35-600.61-200.70.8-1

2、00.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3在碱性环境下，不同的核酸分子由于具有相同的磷酸戊糖结构，几乎具有相同的电荷密度，其电泳行为与SDS-PAGE类似，线性分子在凝胶中的迁移率与其所含碱基对数目的对数值成反比。可以近似用于估算分子的大小影响迁移率的因素DNA分子的大小琼脂糖凝胶的浓度DNA的构象所加电压一般5V/cm电场方向染料的存在与否电泳缓冲液的组成常用电泳缓冲液0.5XTBE5X储液1XTAE50X储液凝胶载样（上样）缓冲液（loadingbuffer)增加样品密度使样

3、品带颜色，起指示作用常用染料EB:溴化乙锭，加入胶中或电泳后染色。EB插入核酸碱基平面，吸收紫外光的能量产生荧光，荧光的强度与DNA的量在一定范围内成正相关SYBR:新型低毒，高灵敏度荧光染料，可直接加入样品中，价格较昂贵胶浓（%）溴酚蓝二甲苯青0.61kb10.6kb2kb1.40.2kb1.6kb20.15kb质粒DNA的电泳鉴定1%琼脂糖凝胶20mL(用buffer配)0.5xTBE100mL2uL质粒DNA+2uL10xloading+3uL无菌水80伏恒压电泳结果用凝胶成像仪分析照相实验流程酶

4、切反应体系管号tube1核酸5uL10xbufferK2uLddH2O12uL酶1uL总体积20uL370C酶解2小时将tube中的样品加入相应的加样BUFFER，用枪混匀后全部轻轻加入胶孔中，电泳到蓝色带距离胶顶端1/3处，戴手套取胶到成象系统中观察。注意不要掉在地上实验安排两人一组，酶切一管，按照步骤加样，注意确定是否已经加入。稍许离心后放入恒温浴槽120分钟。电泳（将所提取的质粒与酶切样品分开电泳）酶切过程中学习制作琼脂糖胶。