限制性内切酶酶切与电泳.ppt

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1、DNA限制性内切酶酶切与电泳分子生物学实验技术重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室刘先俊实验目的掌握DNA酶切的基本原理。学习和了解限制性内切酶的使用方法。学习和了解DNA琼脂糖凝胶电泳的方法实验原理一、限制性内切酶概念是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是基因工程的重要工具。这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶.它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序（回文序列），并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段；Ⅱ型

2、酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-CAATTG-5’EcoRⅠ的识别序列HaeⅠ的识别序列5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNN

3、NNNN5’5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTTpAACNNNNN3’3‘NNNNNCAApTTGNNNNN5’HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端）酶切反应中应注意以下几个问题１．内切酶：2.DNA３．反应缓冲液４．酶解温度与时间二、DNA琼脂糖凝胶电泳原理：琼脂糖凝胶电泳通过电荷效应和分子筛效应分离不同分子量大小的DNA，相同分子量的DNA分子若构型不同电泳速度亦不同。琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片段的典型方法，特点是制备简单、快捷，灵

4、敏。溴化乙锭为ＤＮＡ荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，与与核酸结合成荧光复合物，在紫外线254～365nm照射下呈桔红色荧光。电泳时所需DNA样品量仅0.5～1μg.线性DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系琼脂糖凝胶的百分浓度分离线性DNA片段分离的有效范围(kb)0.360～50.620～10.710～0.80.97～0.51.26～0.41.54～0.22.03～0.1实验方法一、酶切按下表分别加入各试剂（注意限制性内切酶最后加入且在冰上操作）于Eppendorf管中。DNA１μg10×

5、buffer2.5μl无菌水内切酶2μ总体积：25μl２．将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。３．Eppendorf管封上封口膜于３７℃水管中反应２小时。４．反应结束后加入EDTA至终浓度10mM终止反应。５．取１０μl反应液加２μlLoadingbuffer混匀于１％琼脂糖凝胶上４０伏电泳２－３小时。６．紫外透射仪上检查实验结果。二、电泳⒈琼脂糖溶液的制备溴化乙锭浓度0.5μg/mL⒉凝胶板的制备⒊上样⒋电泳电压10v/cm,溴酚蓝移出2/3的距离时，取出凝胶紫外灯下观察结果电泳检测示例