实验三 DNA限制性内切酶 消化酶切.ppt

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1、实验三DNA限制性内切酶消化酶切实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。限制性内切酶酶分子识别位点切割位点限制作用是否需用ATPⅠ类三亚基双功能酶二分非对称至少在识别位点外1000bpYesⅡ类内切酶与甲基化酶分子不在一起4-6bp,大多数为回文对称结构在识别位点中或靠近识别位点无特异性NoⅢ类二亚基双功能酶5-7bp非对称在识别位点下游24-26bpYes限制性内切酶可分为三类Ⅱ类限制性内切酶Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有

2、的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3’)；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。5'…G↓AATTC…3'→5'…GAATTC…3'3'…CTTAA↑G…5'→3'…CTTAAG…5'实验材料和试剂实验材料：玉米基因组DNA实验试剂：BamHI酶及其酶切缓冲液：购买成品。SalI酶及其酶切缓冲液：购买成品。琼脂糖(Agarose)：进口或国产的电泳用琼脂糖均可。实验仪器恒温水浴

3、锅用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底混匀反应体系后，37℃水浴保温2-3h电泳检测EP管编号实验步骤反应体系20μL酶液DNA15μLBamHⅠ1μLSalⅠ1μL10×BufferT3μL对质粒DNA酶切反应限制性内切酶用量可按标准体系1μgDNA加1单位酶,消化1-2h。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。电泳检测示例实验注意事项限制性内切酶用量可按标准体系1μgDNA加1单位酶，消化1-2h。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍

4、，甚至更多，反应时间也要适当延长。酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。许多实验制备的DNA不易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则酶活性将受影响。思考题如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被酶切或者酶切不完全,你认为可

5、能是什么原因？