实验三、质粒DNA的酶切.ppt

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1、实验三、质粒DNA的限制性酶切鉴定、割胶回收与纯化（10学时）1.内切酶的作用原理2.常用的酶切体系及作用条3.影响酶切的因素4.电泳检测5.胶回收试剂盒的操作步骤及注意事项概述没有核酸限制性内切酶的发现和应用，就没有分子生物学的兴旺发展，在基因工程和分子生物学中，没有一种酶像限制性内切酶那样举足轻重和应用广泛。限制性内切酶均来源于原核生物，它们的功能类似高等动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的入侵。核酸限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA的酶，即是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。限制性内切酶

2、作用于磷酸二酯键，使双链DNA中两条单链上的3’,5’-磷酸二酯键断裂，产生的DNA片段5’端为P,3’端为OH,是基因工程的第一步获取目的基因所必须用的酶。限制性内切酶可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)DNA作用，且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机切割识别位点不远处的DNA，不产生特异片段，故在基因重组中没有应用价值。而Ⅲ类酶在特异识别位点上切割DNA分子，其切割位点在识别位点以外（很远的位点），对基因工程的意义不大。Ⅱ类酶由两种酶组成:一种就是通常指的限制性内切酶，它识别并切割某一特异的DNA的核苷酸序列，产生特异的DNA片段；

3、另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列,使A（嘌呤）甲基化。Ⅱ类酶中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础，绝大多数能识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5’-G↓AATTC-3’)，有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3’)；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端（3’突出和5’突出的单链末端）的DNA片段称粘性未端，如EcoRⅠ、PstⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。5'…G↓AA

4、TTC…3'→5'…GAATTC…3'3'…CTTAA↑G…5'→3'…CTTAAG…5’SmaⅠ:5’-CCC↓GGG-3’→5'…CCCGGG..3’3’-GGG↓CCC-5’→3'…GGGCCC..5’Ⅱ类限制性内切酶可分四类：1.异源同工酶：是不同来源分离得来的不同酶，它们有相同的识别序列，切割方式可以相同，也可不同。如HpaⅡ与MspI,它们识别和切割序列相同，但MspI还可识别切割已甲基化的序列，如GGmCC。SmaI和XmaI识别序列相同，但切割位点和方式不同，前者产生平末端，后者产生5‘粘性末端。2.Subset酶：识别与切割序列相互有关的酶互称Subset酶，

5、如SmaI的6核苷酸序列中包含HpaⅡ的4核苷酸序列。Subset酶之间可以代替使用，2个Subset酶消化的DNA片段，可以相互连接，连接后的重组DNA分子，可以被其中一种酶识别，或均不能识别。3.远距离裂解酶：识别位点与切割位点不一致，它们在某一核苷酸区域与识别序列结合，然后滑行到识别序列以外的另一个位点进行切割，一般滑行10个碱基左右。在基因工程中有一定的应用价值。4.可变酶：识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的，且其识别序列一般大于6个碱基，如BglⅠ识别GCC(N5)GGC11个序列，其中5个是可变的。在适当的反应条件下（包括温度、pH、离子强度等），1小时内完全酶解

6、1ug特定的DNA底物所需要的限制性内切酶的量，定义为1个活性单位（1U)。目前市场上的几乎所有的内切酶，均以λ噬菌体DNA作为底物测定其活性单位。限制性内切酶对于DNA底物的酶解是否完全与正确，直接关系到DNA连接、基因克隆分子筛选和鉴定等实验结果。而酶切体系的建立是其中的一个关键步骤，它所涉及的各种因素都必须引起足够的注意。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的灭菌吸管头,DNA要尽量纯，有一定的纯度。DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内

7、切酶的活性：1、DNA纯度，在DNA样品中若含有蛋白质，或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高浓度金属离子，均会降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。2、核酸内切限制酶的缓冲液，核酸内切限制酶的标准缓冲液包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCL、巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等。使用所有限制酶均有可发挥活性的一种缓冲液。不同限制性内切酶对NaCl浓度的要求不同，这是不同限制酶缓冲液组成上的一个主要的不同。据此可分为高盐、中盐