实验六质粒dna的提取与酶切

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1、质粒DNA的提取和酶切实验原理质粒是一种双链的共价闭合DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传的因子。质粒一般來自细菌，分离和纯化质粒DNA的方法很多，但都包括以下几个步骤，细菌的培养和质粒的扩增、菌体裂解、质粒DNA的纯化。在细胞内，质粒以超螺旋的形式存在，在一些条件下，一条链和多处断裂则另一链能自由的旋转形成开环DNA分子。加热或者碱处理虽然可以解开双链中的氢键，但随着冷却或PH恢复到屮性它们又能很好的复性到原来的共价闭合环，线性DNA分子却仍处于变性状态。限制性内切酶以双链DNA为底物，环状和线性DNA均可作为底物，在合适的反应条件十是两条核糖链

2、上特定的磷酸二酯键断开，产生具有3’-0H和5’-P基团的DNA片段。DNA分子在碱性缓冲液屮带负电荷，在电场作用下可以从负极向正极移动，相对分子质量越小，迁移越快，相对分子质量越大，迁移越慢。DNA的构想对迁移也宥一定的影响，向阳极迁移的速度超螺旋大于线性，线性大于开环，电压在一定的范围线性DNA的迁移速率与所加的电压成正比。一细菌培养操作方法：培养基培养基从形态上可分为液体培养基和固体培养基，根据冇无抗生素和其他选择性药物乂分为普通培养基与选择培养基。常用的培养基是以LB液体培养基为基础的各类选择性和非选择性培养基。LB液体培养基：胰化蛋0胨2.

3、5g酵母提取物1.25g氯化钠2.5g加水溶解，用5mol/LNaOH调节pH值到7.0。定容至250ml,高压灭菌20min。固体培养基：普通培养基按LB配方配制液体培养基，加入琼脂(1.5%)高压灭菌20min,取出后在无菌条件下铺制平板。②选择性培养基将消毒好的固体培养基置于室温条件下，降温至50°C左石吋无菌条件下加入抗生素或其他必须添加的成分，每毫升菌液加入氨卞青霉素贮存液(50mg/ml)lulo摇匀后，再将菌液分别倒入已灭菌的平皿中，培养基厚度2-3mm,室温十*固化。细菌的培养大多数人肠杆菌在保存培养基中存活数年，在-70°C低温箱或

4、液氮中吋长期保存。常用保存液为甘油(80%或100%)和DMSO溶液。菌种复苏无菌条件下用接种环或灭菌牙签挑取少许冻结的菌种接种到平皿上，37°C培养8-12小吋。或按“3、小量培养”操作。固体培养用于单菌落或转化后抗性菌落的筛选。无茼条件下用接种环从冻存或新鲜的菌种屮粘取少量菌液，点到平皿培养基的边缘上，以此为起点划一道划痕，接种环火菌，交叉第一道划痕划一•连续的波浪线，接种环火菌，与第-•条波浪线的最盾划痕交叉划第二条波浪线，如此重复直至划满平板培养基，注意波浪线之间不能交叉重叠，37°C培养8-12小时。小量培养取灭菌试管加入3-5ml液体培养

5、基和3-5ul氨苄靑霉素溶液，用无菌牙签从固体培养基细菌平皿中挑取一单菌落接入液体培养基中，或取菌液5-lOul接入液体培养基，封I」，37°C振荡培养6-12小时。大景培养已灭茼的500ml三角瓶中加入100-200灭尚的液体培养基及和应量的氨苄青霉素溶液，0.5%-1%的浓度接入菌液，封U,37°C振荡培养至QD600nm0.6-0.8。二、碱裂解法提取质粒DNA一.试剂STE溶液：含O.lMNaCl,0.1MTris•HC1（pH8.0）,0.001MEDTA（pH8.0）的溶液，高压蒸汽灭菌。（50ml）溶液I:含005M葡萄糖，0.025M

6、Tris•HC1（pH8.0）,0.01MEDTA（pH8.0）的溶液，储存于4°C。（50ml）溶液II:含O.2MNaOH，l%SDS的溶液,先配制0.4MNaOH（现配现用，不用灭菌）和2%SDS（十二烷基磺酸钠）取0.4MNaOH和2%SDS按1:1（V:V）的比例混匀。（现配现用，不用灭菌）（50ml）溶液III:称取29.4gKAc溶于80ml双蒸水，加入11.7ml冰醋酸后再定容至100mlo高压蒸汽灭菌，储存于4°C。（100ml）酷/氯仿/异戊醇混合液（25:24:1,V：V：V）：将10mlTris饱和酚/10ml氯仿/0.4ml

7、异戊醇按比例'混匀。70%乙醇（50ml）、无水乙醇（50ml）（_20°C预冷）RNA酶液20mg/mg（0.5ml）（用时稀释1000倍）二.操作方法A细菌的收获1.取1.5ml培养物到Ep管中，用微量离心机以12000g,离心30秒钟，吸去培奍液，用lmlSTE溶液先沉淀一次（即用STE溶液重悬菌体沉淀，12000g离心30秒钟，弃去上清液）。B碱裂解法提取质粒：1将细菌沉淀重悬于lOOpL预冷的溶液I屮，振荡器上剧烈振荡浞匀。2加入200（jL新配制的溶液II,盖紧管口，快速颠倒离心管5次以混匀，不要振荡。将离心管至于冰上5分钟。3加入150

8、^1预冷的溶液III盖紧管口，倒置后温和的振荡10秒，使溶液分散均匀，之厄将离心管至于冰上3-5分钟。44°