感受态细胞的制备和转化课件.ppt

《感受态细胞的制备和转化课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、实验三感受态细胞的制备和转化一实验原理转化作用是在一定条件下，一种特定的DNA分子（供体或称转化因子）转入到一定的细菌体内（受体菌），使其发生遗传形状改变的过程。在正常生长条件下，少数细菌可发生转化作用，但大多数细菌并不发生转化，只有在一定条件作用下（如用Ca++处理细菌细胞或电刺激），细菌呈现感受状态后，外源DNA才能转化进入受菌体内。因此，若想将外源DNA分子转化进入一定的受菌体内，通常需将受体菌先制备成易感受状态。一实验原理感受态通常指的是细菌具备吸收转化因子的一种生理状态。一般说来，细菌细胞在对数生长的早中期，经处理后，有一

2、定的转化能力，但在它们进入静止生长期以后，就逐渐丧失。因此进行细菌细胞转化时，掌握合适的细菌培养时机是很重要的。本实验所用的供体DNA分子为一个重组质粒，含有编码日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶（GST）的基因。因此可在受体菌体内将表达出GST。实验中所用的受体菌为大肠杆菌BL21（DE3）选择此菌株是因为可用乳糖替代IPTG作为目的基因表达的诱导剂，使实验的进行更为经济。LB液体培养基：1000ml含蛋白10g酵母提取物5gNaCl10g，溶于950ml双蒸水中，用NaOH调pH至7.0，然后定容为1000ml。15磅20分钟高压灭菌。

3、需加抗菌素时，冷却至50℃以下，加入相应浓度的抗菌素。LB固体培养基：向LB液体培养基中加入2.0%的琼脂粉，15磅20分钟高压灭菌，然后加入适量抗菌素，向每个平板中倒入15-20mlLB固体培养基，凝固后倒置，4℃保存。转化试剂：CaCl2溶液（lM）：取54gCaCl2·6H2O溶于20ml无菌水中，15磅20分钟灭菌后，分装成小份于4℃保存。二实验试剂菌株与质粒：大肠杆菌BL21（DE3）[hsdSgal（λcits857indlsam7ni5lacuv5-T7genel）]。质粒pGEX-6p。二实验试剂1大肠杆菌BL21（

4、DE3）感受态细胞的制备将一BL21（DE3）单菌落种于20mlLB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。取5ml上述菌液转种于50ml培养液中，37振荡培养约1小时，至0.D600值为0.4-0.5左右，停止培养，菌悬液于冰上冷却10分钟后，转至40ml灭菌离心管中，在4℃，4000rpm离心10分钟，弃上清，菌体悬于10ml预冷的无菌的0.1MCaCl2溶液中，冰浴15分钟，然后在4℃4000rpm离心10分钟。弃上清，菌体重新悬于2ml预冷的无菌的0.1MCaCl2溶液中，置冰上3-4小时后即制得感受态细胞。三操作步骤2重组质粒p

5、GEX-6pDNA的转化取上述感受态细胞200µ1，加重组质粒DNA2µ1（约10ngDNA），混匀后，冰上作用30分钟，然后转到42℃水浴进行热休克90秒，快速转移样品到冰浴，预冷1-2分钟，加0.8mlLB液体培养基，37℃培养45分钟后取原液各0.2ml涂布Amp平板，同时将0.2ml感受态细胞涂布于Amp平板作为对照。倒置平板，37℃恒温培养箱中培养12-16小时，观察对照转化的平板，观察转化子出现的数目，计算转化效率。所得的到的单菌落即为菌株BL21（DE3）pGEX-6p。三操作步骤转化效率计算公式如下：转化子总数转化频

6、率=DNA加入量=转化子/µgDNA转化子总数=转化菌落数*稀释倍数*转化反应液体积四实验结果1试总结出实验成功的关键步骤。2用乳糖作为BL21（DE3）菌株目的的基因表达的诱导剂的作用机制是什么？3在用氨苄青霉素作为抗菌素筛选转化子是，一般37℃培养时间不超过20小时，为什么？4氯化钙转化与电转化相比有哪些优点和缺点。五思考题