实验--感受态细胞制备及转化.ppt

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1、实验:大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验目的掌握制备和保存大肠杆菌感受态细胞的方法掌握转化的方法技术了解转化过程中各因素对转化率的影响实验背景简介重组蛋白为什么表达量不高或不表达？重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量为什么偏小？有些大肠杆菌表达重组蛋白为什么没有活性？总是形成包涵体？基因表达体系1.原核体系2.真核体系pJLA50X系列;pcDNAII;etcpET系列(T7promoter,Novagen公司)pQE系列(T5promoter,Qiagen公司)pMAL系列(周质表达,BioLabs公司)pGEX系列(

2、GST融合表达,Pharmacia公司)pBAD系列(Arabinose诱导型)常用表达载体pTYB系列(CBD融合,可以自我切割,BioLabs)受体细胞应具备的条件外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）限制性缺陷型重组整合缺陷型用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）防止重组细菌扩散污染，生物武器除外具有较高的转化效率具有与载体选择标记互补的表型感染寄生缺陷型大肠杆菌(Escherichiacoli)遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；基本不分泌，易形

3、成包含体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰枯草杆菌(Bacillussubtilis)分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构；无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；质粒不稳定大肠杆菌常用克隆菌株JM109HB101DH5aXLblueTG1C600外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）及重组整合缺陷型（recA-）BL21(DE3)/pLysS:自身表达T7RNApolymerase适用pET系列等带T7启动子的载体M15/SG13009:自身表达T5RNApoly

4、merase适用pQE系列等带T5启动子的载体BL21TrxB(DE3):thioredoxinreductase突变Origami:thioredoxinreductase/glutathionereductase双突变适合带thioredoxinreductase的融合表达载体,帮助形成正确的二硫键BR21CodonPlusRIL:富含AT的真核生物基因的表达BR21CodonPlusRP:富含GC的真核生物基因的表达Rosetta-gami™：识别稀有密码和正确折叠特殊的表达用菌株体系选择研究基因功能:大肠杆

5、菌,裂殖酵母,昆虫细胞,CHO细胞多肽药物生产:大肠杆菌,毕氏酵母,CHO细胞,乳腺组织疫苗:大肠杆菌,酵母,单抗生产:杂交瘤细胞工业酶生产:各种微生物受体菌与质粒的选择受体菌：E.ColiDH5α：无Ap抗性外源质粒Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力选择:如进行蓝白斑筛选时可选用DH5α、JM109、TG1；用T7启动子进行原核表达时可选用BL21(DE3)；0感受态及转化实验原理定义感受态（Competence)：细菌处于容易吸收外源DNA的状态

6、转化（transformation)：异源DNA分子导入受体细胞的过程致敏过程:用理化方法诱导细胞进入感受态的操作细菌产生感受态的类型自然转化（naturaltransformation）在生长周期的任何时刻自动产生感受态；（e.g.枯草杆菌）工程转化（engineeredtransformation）在生长周期的特定时刻产生感受态；（e.g.大肠杆菌）感受态细胞形成的两种假说1、局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进细胞。2、酶受体假说——感

7、受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。大肠杆菌感受态细胞制备的原理大肠杆菌自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。在转化实验中，通常先采用人工的方法制备感受态细胞，代表性的方法之一是Ca2+诱导法。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化：①在0℃的Cacl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时Cacl2使细胞膜

8、磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。该法重复性好。操作简便快捷，适用于成