感受态细胞的制备和转化

《感受态细胞的制备和转化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、感受态细胞的制备和转化2013/3/26第一节概述在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，

2、即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ，Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2，RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受

3、态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培养液的OD

4、600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。试剂的质量:所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或

5、AR.)，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管、tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。第二节感受态细胞的制备一、材料：大肠杆菌E.coliDH5α，100ml三角瓶，1.5ml离心管(又称eppendorf管),离心管架，1000ul、200ul枪头，大量冰块，二、设备：微量移液器(20

6、0μl,1000μl)，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，恒温摇床、冷冻离心机,超净工作台,紫外光度计，双蒸水器，冰箱等。三、试剂准备1、LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调pH至7.0,加水至总体积1升，高压下蒸气灭菌15分钟。2、LB固体培养基：液体培养基中每升加15g琼脂粉，高压灭菌。3、高压灭菌的0.1MCaCl2：称取1.11gCaCl2(无水，分析纯)，溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高压

7、灭菌。4、含15%甘油的0.1MCaCl2：称取1.11CaCl2(无水，分析纯)，溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌。感受态细胞的制备和转化2013/3/26四、操作步骤(CaCl2法)（1）（已预先准备好）从新活化的E.coliDH5α菌平板上挑取单个DH5α大菌落（超净工作台操作），接种于3～5mlLB液体培养中，37℃振荡（210-240r/min）培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1：100～1：50转接于20mlLB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开

8、始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养（培养2～3h至OD600＝0.5左右）；（2）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管（Falcon2070）中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。切记：下述所有步骤均需无菌操作(在超净工作台完成。)。于4℃以4000转/分离心10分钟，以