枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化

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1、枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化采用改进的Spizizen法进行，详述如下：A，试剂SPI-ASaltsSolution：0.4%硫酸铵（NH4）2SO41322.8%K2HPO4·3H2O2281.2%KH2PO41360.2%TrisodiumCitrateDihydrate（柠檬酸三钠-2-水）即二水合柠檬酸三钠210121°20min灭菌（每次用完要灭菌）SPI-BSaltsSolution：0.04%MgSO4*7H2O120121°20min灭菌（每次用完要灭菌）100×CAYEsolution:2%Casaminoacid（酪蛋白水解物）　1

2、0%YeastExtract121°20min灭菌（灭菌一次，每次在超净台取样）100×EGTAsolution：10mMol/LEGTA(NaOH调pH至8.0)SPIMedium（20ml）SPIIMedium（6ml）9.8mlSPI-ASaltsSolution5.88mlSPIMedium9.8mlSPI-BSaltsSolution60ul50mMCaCl2200ul50%Glucose（0.1g）60ul250mMMgCl2200ul100×CAYEsolution注：SPI、SPII量比较少，容易干，确保大肠转化成功再配。B感受态细胞的制备和

3、转化1.前一天晚上挑取宿主菌（单菌落）接种于一支5mlLB液体摇瓶，37°摇床过夜2.第二天早上取100ul过夜培养的菌液，接种于50ml离心管配好的5mlSPIMedium中，37°摇床培养，3h后开始测OD600（一般不用测），当培养物声场到对数末期时，快速取200ul接种到2mlSPIIMedium中，37°100rpm1.5h3.加20ul100×EGTA溶液，37°100rpm10min，用1.5ml离心管分装成500ul每管4.向管中加入适当的质粒，5-10ul，轻轻混匀与37°100rpm30min5.将离心管转移到250rpm，37°，1.5

4、h6.以4000rpm离心收集菌体。弃部分上清，留100ul重悬菌体，涂布于响应的抗性平板。37°过夜。离心管选用10ml或者50ml带螺帽的底部尖的离心管。感受态细胞不能保存，因此，需要现做现用大肠的抗性（Amp），枯草的（Kan）枯草芽孢杆菌感受态的制备与转化（1）挑取枯草芽孢杆菌168单菌落与3mL液体LB培养基中，37℃过夜培养（2）取100ul过夜培养物，接种于5mlSPI培养基中，37℃，200rpm震荡培养，当培养至对数期末期，快速取200ul接种于2ml的spII培养基，37℃，100rpm震荡培养，培养1.5h（3）加入20ul100×EG

5、TA溶液，37℃，100r/min震荡10min（分500ul/管）（4）向管中加入适量质粒1-5ul，混匀，37℃，100r/min，震荡30min。（5）调整摇床转速，250r/min继续培养1-2h（6）取适量体积的细胞，涂布在含有相应抗生素的LB平板上，过夜培养枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备（可保存的）1.LB平板上，37℃过夜培养2.挑单菌落，接种于5mlGMⅠ溶液，30℃125rpm，摇床过夜培养3.次日，取2ml转接到18mlGMⅠ中，37℃，250rpm，3.5h4.再取10mL上一步骤的培养液转接到90mLGMⅡ中，37℃，125rpm，1.

6、5h，5000rpm10min5.用10mL原培养液上清液轻轻旋复浮菌体，即为感受态细胞6.加30%的灭菌甘油至终浓度10%（500ul/管）10×最低盐溶液（100mL）K2HPO414gKH2PO46g（NH4）2SO42gNa3C6H5O7·2H2O1g（二水合柠檬酸三钠）MgSO4·7H2O0.2g氨基酸溶液2mg/ml，贮存于棕色瓶内，113℃灭菌30min，用黑纸包裹GMⅠGMⅡ1×最低盐溶液95mL1×最低盐溶液97.5mL50%葡萄糖1mL50%葡萄糖1mL5%水解酪蛋白0.4ml5%水解酪蛋白0.08ml10%酵母汁1mL10%酵母汁0.0

7、4mL2mg/mL氨基酸溶液2.5ml0.5MMgCl20.5mL0.1MCaCl20.5ml2mg/mL氨基酸溶液0.5ml枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化方法1.挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37°过夜培养；接种量1%至growthmedium（LB含有0.5M山梨醇），37°培养至OD600nm为0.85-0.95；2.冰上预冷10min后，转至预冷的50ml离心管，4℃，5000rpm离心5min；用冰冷的EM（electroporationmedium,0.5M山梨醇；0.5M甘露醇36.434g；10%甘油），洗四次，将培养液中的成分全部去

8、除；3.将沉淀悬于1/40体积冰冷的EM中，使细胞终