大肠杆菌,枯草杆菌,地衣芽孢杆菌以及酵母的感受态制备及转化

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1、地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化条件探索及优化见文献。接种新鲜Bacilluslicheniformis2709单菌落至10mL芽孢杆菌基本培养基中，37℃剧烈振荡培养16~18h，250r/min，培养至OD600为1.0时，取1.5mL该培养液加入到10mL37℃水浴预热的40mL新鲜芽孢杆菌基本培养基中。37℃剧烈振荡培养4h，250r/min。加入10mL芽孢杆菌饥饿培养基，37℃剧烈振荡培养4h，250r/min。将细菌在冰水浴冷却15min，分装于0.5mLEppendorf

2、管中，于4℃10000r/min离心10min，沉淀用预冷的水轻轻溶解悬浮，可直接进行实验，也可于-70℃冻存。将新鲜制备的转化前细胞0.5mL在4℃10000r/min下离心10min，弃上清，加入0.5mL冰水悬浮，如此反复洗涤细胞三次，轻柔操作，冰浴10min分别加入不同浓度的质粒DNA，混匀，将溶液转移到预冷的无菌电转化池中，吸干池表面的水分，将电转化池放入电转仪的样品槽中，在电场强度为25μF、不同的电压下电击转化。迅速取出电转化池，加入1mLBY液体培养基稀释细胞，37℃水浴摇床培养1.5h，取200μl涂布于LB固体卡那霉素抗性平板

3、上，37℃培养。阳性转化子的筛选将阳性转化子点种于酪素固体卡那霉素抗性平板上筛选，观察透明圈。以地衣芽孢杆菌为宿主进行电转化研究转化首先要考虑宿主细胞的感受态的形成能力，对于大肠杆菌为宿主细胞，经过CaCl2处理以后可以使大肠得到较好的感受态性能，可使每微克质粒转化得到107个转化子，而对于革兰氏阳性菌如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌要使其经过特殊处理得到较好的感受态性能并非易事，因为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌在感受态细胞形成和DNA转化的机制上有很大的不同，目前有关机理还知道得很少，所以使用于处理革兰氏阴性菌的方法并不适用于革兰氏阳性菌[7]。然而在工

4、业生物技术的研究和应用中，十分需要以分泌型革兰氏阳性菌为宿主的菌株，这对产品的后提取和精制很有意义，特别是在以基因工程手段进行的新菌种的构建过程中更是十分必要。在细菌中能够形成感受态的细胞是很少的，一般认为0.1%-1%，而且细菌处于感受态是短暂的，肺炎双球菌、枯草杆菌、地衣芽孢杆菌等是这类菌。一般认为感受态是在细菌生长对数后期产生的。诸多研究表明，芽孢杆菌在营养缺乏的饥饿状态下，细胞易产生感受态因子，处于生长芽孢时期的芽孢杆菌更容易产生感受态[8~9]。作者在实验中正是基于此原则利用芽孢杆菌极限营养培养基使地衣芽孢杆菌处于产生感受态因子的状态，

5、并结合电转化，同时探索了影响电转化效率的有关参数[10]。根据摸索的条件，将浓度为1.5μg/mL的整合质粒在1750V、电场强度为25μF下对诱导型感受态细胞成功地进行了电转化。将电转化所得到的转化子进行挑选，点种转移至酪素固体卡那霉素抗性平板上筛选，37℃培养12h，可以观察到这些转化子周围均产生明显透明圈，如图4-2所示，说明整合型质粒pAPR1成功转化入宿主细胞，并将碱性蛋白酶基因插入到宿主染色体中成功表达，转化子均为阳性克隆子。枯草杆菌化学感受态制备及转化方法试剂枯草杆菌化学感受态制备及转化方法l        试剂SPI－ISalts

6、Solution：（500gSolution）0.4％      (NH4)2SO4                                                                  0.2g2.8%      K2HPO4·3H2O                                                  1.4g1.2%      KH2PO4                                                                      0.6

7、g0.2%      TrisodiumCitrateDihydrate                0.1g121℃灭菌20minSPI－IISaltsSolution：（500gSolution）0.04%    MgSO4·7H2O                          0.02g121℃灭菌20min100×CAYESolution：（100gSolution）2％        Casaminoacid                          2g10％      YeastExtract            

8、                10g121℃灭菌20minSPIMedium：（20mL）9.8mL    SPI－ISaltsSol