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1、最新医学类-感受态细胞的制备与质粒DNA的转化-药学医学精品资料所谓感受态,就是细菌吸收转化因子的生理状态。关于感受态的本质与存在,说法很多,目前主要有两种假说:１．局部原生质体化假说－－感受态细胞的表面形成一种能接受ＤＮＡ的酶位点,使ＤＮＡ分子能进入细胞。1、感受态细胞的制备这和受体菌:质粒ＤＮＡ的选择相关,原则上要注意:１．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株;２．根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则而定。重组子的筛选方法常用的有两种方法:抗生素筛选法互补法3.重组子的筛选菌株为某种抗生缺陷型,而质粒上带有该抗性基因(如氨苄青霉素,卡
2、拉霉素等)这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。本实验利用抗生筛选转化子。１．抗生素筛选法现在使用的许多载体(如ＰＵＣ系列)有含有一个大肠杆菌ＤＮＡ的短区段,其中含有β－半乳糖苷酸基因(lacZ)的调控序列和头１４６个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。当外源基因插入时,二者溶为一体后,有β－半乳糖苷酶表达,在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷(x-gal)培养基中形成兰色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点,从而造成插入失活,而使lacZ基因不表达而形成白色菌
3、斑。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。２、互补法菌种:E.coliDH5a(空)、E.coliK12(空)设备:eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl),台式高速离心机,涡旋振荡器试剂:LB液体培养基、0.1mol/LCaCl2、Amp二、材料、设备及试剂一、感受态细胞的制备(一)、受体菌的培养(二)、感受态细胞的制备(CaCl2法)1、将1.5ml(每人)培养液转入离心管中,于4℃下3000g离心10分钟。2、弃去上清,用预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液1ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,
4、4℃下3000g离心10分钟。3、弃去上清,加入200μl预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。4、感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。二、转化1、取200μl感受态细胞悬液置冰上。2、加入1-10ulDNA,轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。3、42℃水浴中热击2min,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。4、向管中加入1mlLB液体培养基,混匀后37℃振荡培养45min-1小时。5、将上述菌液摇匀后取200μl涂布于含Amp的筛选平板上,待菌液完全被培养基吸收后倒置
5、培养皿,37℃培养16-24小时。对照:另取未转化感受态细胞分别涂布筛选平板(Amp终浓度50ug/ml)和空白平板实验结果:下次实验观察并分析筛选结果四、注意事项为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素:1.细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌,最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不
6、足均会影响转化效率。四、注意事项2.质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。四、注意事项3.试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。4.防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如
7、离心管,tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。感受态细胞低效抗生素使用错误转化后立即涂板忘记温浴使用高效率的感受态细胞(106以上)复查质粒抗性,使用正确的抗生素转化后温浴45min左右,让抗性基因得以表达。五、质粒DNA转化常见问题问题一:转化后无克隆产生原因对策未加IPTG/X-Gal或其失效抗生素失活,敏感菌亦能生长用于制备感受态的菌株退化,丢失了某些重要因子检查平板是否含有IPTG/X-G
8、al以及是否新鲜,如平板有问题,重新制备新鲜平板复查抗生素的抗性用于制备感受态的菌株,传代次数不能太多(20代以内为佳)五、质粒DNA转化常见问题问题二:实验组只有白色菌落(没有蓝色菌落)原因
