实验3酵母蔗糖酶的制备.doc

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1、个人收集整理勿做商业用途实验3酵母蔗糖酶的制备一、实验目的1、学习、掌握提取啤酒酵母中的蔗糖酶2、学习用紫外分光光度法测定蛋白质含量二、实验原理蔗糖酶催化蔗糖水解成为果糖和葡萄糖的一种酶，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到，特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。啤酒酵母中含有大量的蔗糖酶,通过研磨破细胞壁，使酶游离出来，用水萃取酶，然后用有机溶剂沉淀酶蛋白得到粗制品，还可用柱层折进一步纯化得到精制品.三、实验器材1、试剂:二氧化硅、去离子水(使用前冷至4℃左右）、冰块、食盐、1mol/L

2、乙酸、95％乙醇。2、材料：啤酒酵母、3、仪器：研体、恒温水浴锅、高速冷冻离心机。四、实验步骤1研磨水提取（1)准备一个冰浴，将研钵稳妥地放入冰浴中.（2)称取1g啤酒醉母和适量（约5mg)二氧化硅一起放入研钵中，二氧化硅要预先研细.(3）缓慢加入预冷的30m1去离子水．每次加2m1左右，边加边研磨．至少用30分钟，至酵母细胞大部分研碎，将蔗糖酶充分转入水相。（4）将混合物转入离心管中，平衡后．用高速冷冻离心机离心，4℃，10000r／min，离心15min。(5)用滴管小心地取出水相，转入另一个清洁的离心管中,4℃,10000r／min，离心15min。(6）将上清液转入量筒，量出体积。用

3、广泛pH试纸检查上清液PH，用lmol/L乙酸将pH调至5.0，称为“级分I”。(级分I总共量了28ml）留出5m1测定酶活力及蛋白含量，剩余部分转入清洁离心管中。2热处理和乙醇沉淀(1）预先将恒温水浴调到50℃,将盛有级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30min，在保温过程中不断轻摇离心管。个人收集整理勿做商业用途（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却,4℃．10000r／min,离心10min。（3）将上清液转入小烧杯中，放人冰盐浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），缓慢地加入等体积预冷至—20℃的95%乙醇,同时轻轻搅拌．再在冰盐浴中放置l0min、以沉淀完全。于4℃、10000r／m

4、in，离心10min,倾去上清液,并滴干，沉淀保存于烧杯中，盖上盖子或薄膜封口，然后将其放人冰箱中冷冻保存（称为“级分Ⅱ）。3紫外吸收法测定蛋白质(1)取待测样品（本实验提取的级分1和级分Ⅱ）置于石英比色皿中，紫外分光光度计280nm和260nm出测定OD，用去离子水作为空白对照；（2）根据下列公式计算样品中蛋白质含量蛋白质含量（mg/ml）=1.55OD280—0.76OD260五、实验思考1。为什么酶的提取需要低温操作?2．热处理的目的是什么？个人收集整理勿做商业用途实验4　蔗糖酶的活性和比活力测定一、实验目的1、掌握酶活性测定的方法和原理2、测定级分Ⅰ、Ⅱ的酶活性，学习酶比活力计算。二

5、、实验原理1、蔗糖＋蔗糖酶（水解酶）→D—果糖＋Ｄ－葡萄糖用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度。本实验中，蔗糖酶的活力单位指在一定条件下反应５min，每产生１mg葡萄糖所需的酶量.２、DNS试剂＋Ｄ－葡＋强碱液中＋沸水浴生成氨基化合物(棕红色）三、实验器材1、试剂：葡萄糖2mol/L、蔗糖0.2mol/L、1mol/LNaOH、DNS试剂：酒石酸钾钠18。2g,溶于50ml蒸馏水中,加热（不超过50℃），于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸0.63g,,NaOH21。0g,苯酚5.0g，无水亚硫酸钠5。0g,搅拌至溶解完全，冷却后用蒸馏水定容至1000mL,贮存于棕色瓶

6、中，室温保存。2、仪器:分光光度计、水浴锅3、材料：实验3所得级分Ⅰ、Ⅱ的蔗糖酶四、实验方法1．工作曲线的制作取６只试管，按下表加入2.0mg∕ml葡萄糖标准液和蒸馏水管号　　葡标准液∕ml蒸馏水∕ml葡含量∕(mg.ml)-1１　　０　　　　　　　　　１　　　　　　　　０２　　0.20。80。430.40。60.840.60。41。250。80.21。661。002个人收集整理勿做商业用途在上述试管中＋ＤＮＳ试剂２ml，沸水浴５min，流动水迅速冷却,各加蒸馏水９ml，摇匀，在540nm波长测光吸收值，以葡含量（mg∕ml）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。2．酶液的稀释（级分Ⅰ、

7、级分Ⅱ)　各取0.2ml稀释10倍，得到2ml稀释液。3．吸光度的测定取２ml稀释后的酶液＋２ml0.2mol∕L蔗糖,立即摇匀开始计时,35℃水浴５min，立即加入１ml1mol/LNaOH中止反应。取1ml的反应液＋２mlDNS试剂，沸水浴５min，立即用流动的自来水冷却后，加入９ml蒸馏水，进行吸光度的测定。4．计算酶的活力　稀释后的酶活力→原始酶活力（1)酶活力计算：在室温、pH4。5 条件下，每分钟