大实验酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究

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1、大实验酵母蔗糖酶的提取及其性质的研宄本实验为学生提供一个较全的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质作初步的研究。一.实验原理及相关知识(1)蔗糖酶的介绍自I860年Bertholet从酒酵母SacchacomycesCerevisiae中发现了簾糖酶以来，它己被广泛地进行了研究。薦糖酶(invertase)(fructofuranosidefructohydrolase)(EC.3.2.1.26)特异地催化非还原糖中的?一呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。(

2、2)。实验原理：本实验提取妞包酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶(externalyeastinvertase),其活力占鹿糖酶活力的大部分，是含省50%糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内鹿糖酶(internalyeastinvertase),含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met,它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的

3、差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很表如下：少，极难提取，木实验提取纯化的主要是外酶。两种酶的性质对照实验屮，用测定生成还原糖(葡萄糖)的量或旋光法来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋G质的活力单位数。本实验共有以下分实验：一、蔗糖酶的提取与部分纯化二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定四、反应时间对产物形成的影响(一)蔗糖酶的提取与部分纯化：一、实验冃的：学习酶的纯化方法。二、试剂：面包酵母二氧化硅蒸馏水(使

4、用前冷至4°C左心)冰盐浴1N乙酸95%乙醇四、操作步骤：1.提取(1)称取5g干酵母，称10g二氧化硅，放入研钵中。(2)量取预冷的蒸馏水30ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需60分钟。研磨时可以用显微镜检査研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。(1)将混合物转入离心管屮，平衡后，用离心机离心,4000rpm，30min。如果上层白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层脂肪层弃(1)用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，注意不要取沉淀，将清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁离心管中。(8)用广泛pH试纸检

5、查清液pH,用IN乙酸将pH调至5.0,称为“粗级分I”。1.热处理(1)预先将恒温水浴调到50°C,将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，5(TC下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。(2)取出离心管，于冰浴中迅速冷却，4000rpm,离心30min。(3)将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量(称为“热级分II”)。2.乙醇沉淀将热级分II转入小烧杯中，放入冰盐浴(没有水的碎冰撒入少量食盐)，逐滴加入等体积预冷至一20QC的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟，以沉淀完全。4000rpm,

6、离心30min，倾去上清，并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存(称为“醇级分III”)。废弃上清液之前，要用尿糖试纸检查其酶活性(于下一个实验一起做)。3.酶活力的测定利用旋光仪进行操作，一致的位置，再从度盘上读数。读数是正的为右旋物质，读数是负的为左旋物质。将旋光仪接于220V交流电源。开启电源开关，约5分钟后钠光灯发光正常，就可开始工作。(2＞检查旋光仪零位是否准确，即在旋光仪未放试管或放进充满蒸馏水的试管时，观察零度时视场亮度是否一致。如不一致，说明有零位误差，应在测量读数中减去或加上该偏差值。或放松度盘盖背面

7、四只螺钉，微微转动度盘盖校正之(只能校正0.5Q左右的误差，严重的应送制造厂检修)。(1)选取长度适宜的试管，注满待测试液，装上橡皮圈，旋上螺帽，直至不漏水为止。螺帽不宜旋得太紧，否则护片玻璃会引起应力，影响读数正确性。然后将试管两头残余溶液楷干，以免影响观察清晰度及测定精度。(2)按下表各组分配置溶液，注满试管，如有气泡，则把气泡移到中间，在进行测定。管数酶液0.5ml乙酸缓冲液(0.2mol/LpH4.9)H2O(ml)1.55III1.55III1.55IV1.55鹿糖0.05M(ml)3333旋光值a转化率(％)转化率(％)X15000?MX0.

8、01L(5>:转动度盘、检偏镜、在视场中觅得亮度，测定后，将实验数据记录下来，此