酵母蔗糖酶的提取及性质测定.doc

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1、酵母蔗糖酶的提取及性质测定引论及原理酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。本实验属综合性实验，接近研究性实验，包括八个连续的实验内容，通过对蔗糖酶的提纯和性质测定，了解酶的基本研究过程；同时掌握各种生化技术的实验原理、基本操作方法。本实验技术多样化，并且多个知识点互相联系，实验内容逐步加深，构成了一个综合性整体，为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。蔗糖酶（invertase）（b—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranosidefructohyd

2、rolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的a—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol蔗糖，就生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。＋　H2O蔗糖酶OHHO　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性

3、变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。一、蔗糖酶的提取与部分纯化（一）实验目的学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。（二）实验原理（略）（三）实验仪器、材料及试剂　　仪器1.高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱2.电子天平、研钵（＞200

4、ml）、制冰机、50ml烧杯3.离心管（2ml，10ml，30ml或50ml）、移液器（1000ul）或滴管、量筒　材料及试剂1.市售鲜啤酒酵母（低温保存）1.石英砂（海沙）、甲苯（使用前预冷到0℃以下）2.95%乙醇（预冷－20℃）、去离子水（使用前冷至4℃左右）3.Tris-HCl（pH7.3）缓冲液（四）操作步骤1.提取（1）将市售鲜啤酒酵母2000rpm，离心10min，除去大量水分。（2）将研钵稳妥放入冰浴中。（3）称取50g鲜啤酒酵母，加30g石英砂放入研钵中，加50ml预冷的甲苯（边研边加）或预冷的去离子水，在研钵内研磨成糊状，然后每次缓慢加

5、入预冷的10ml去离子水，边加边研磨以便将蔗糖酶充分转入水相。共加75ml去离子水，研磨约40~60分钟，使其成糊状液体。（注：研磨时可用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎）。（4）将混合物转入50ml（或分装入2个30ml）离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机离心，4℃，15000rpm，15min。观察结果：如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。　（4）用移液器（或滴管）吸出上层有机相（弃掉）。（5）用移液器小心地取出脂肪层下面的水相液转入量筒，量出体积，并记录。（6）取出2ml放入2ml离心管中（标记为粗级分I，－20℃下保存），用于测定酶

6、活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中。2.热处理（1）将盛有粗级分I的小烧杯迅速地放入50℃恒温水浴中，保持30分钟，并用玻璃棒温和搅动。（2）取出小烧杯，迅速用冰浴冷却，转入清洁的离心管中（根据量大小选择离心管），4℃，15000rpm，离心15min。（3）将上清液转入量筒，量出体积，并记录。（4）取出2ml放入2ml离心管中（标记为热级分II，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中。3.乙醇沉淀（1）将盛有热处理后的上清液放入小烧杯，在冰浴下逐滴加入预冷的等体积（逐滴加入）95%乙醇，温和搅拌、放置，需1小时。（

7、2）转入清洁的离心管中，用4℃，15000rpm，离心15min，倾去上清，并滴干。（3）离心管中沉淀用5~8mlTris-HCl（pH7.3）缓冲液充分溶解（若溶液混浊，则用离心管，4000rpm离心除去不溶物），转入量筒，量出体积，并记录。（4）取出2ml放入2ml离心管中（标记为醇级分Ⅲ，－20℃下保存），用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中，用于下一步实验。（注：离心管中沉淀也可盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存，用时再处理）（五）实验结果与分析记录实验结果，并加以解释，若有异常现象出现，可进行分析讨论。（六）注意事项　

8、二、DEAE-纤维素层析纯化蔗糖酶（一）实验目的学会离子交换柱层析