啤酒酵母的蔗糖酶的提取、提纯及测定.doc

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1、浙江工业大学药学院生物化学实验论文2013年12月13日啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：（1），蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液A；b、接着调PH并加热、离心得热提取液B；c、用乙醇沉淀离心得提取液C。（2），蔗糖酶的纯化—QSepharose柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液D。（3），蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反应后的OD540值，得各提取液的酶活

2、力与回收率。（4），蔗糖酶蛋白质含量的测定及活力计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的OD660值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍数。(5),微量凯氏定氮法（以B为样品）：先将样品B消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用HCl滴定馏出液，计算蛋白质含量。（6），SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量：首先制备分离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚

3、试剂；微量凯式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳；正文：文献综述蔗糖酶(Sucrase,EC3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。蔗糖酶的最适温度为45℃-50℃，最适ph为4.0-4.5.实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会1蔗糖酶的提取及初步提纯1.1实验原理酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液

4、法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。1.2试剂与器材1.2.1试剂①啤酒酵母；②醋酸钠（AR）；③甲苯（AR）；④4mol/L醋酸；⑤95%乙醇（<-20℃）；⑥0.5mol/LTris-HClpH7.3缓冲液。称取121.1gTris溶于1500ml的蒸馏水中，用4mol/LHCl调节pH至7.3（HCl量约为230ml），用蒸馏水稀释到2L，即为0.5mol/LTris-HClpH7.3缓冲液。⑦0.05mol/LTris-HClpH7.3缓冲液：将0.5mol/LTris-HClp

5、H7.3缓冲液稀释10倍即得。注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。1.2.2器材①锥形瓶250ml（×1），50ml（×1）；②量筒10ml（×1）25ml（×1）;③烧杯100ml（×1），1000ml（×1）；④具塞试管10ml（×3）；⑤吸球、玻棒、滴管、pH试纸；⑥培养箱；⑦恒温水浴箱；⑧磁力搅拌器，搅拌子；⑨高速冷冻离心机。1.3操作方法1．酵母的自溶：在弱碱中培养60小时；2．初提取液A：取出酵母自溶液体，经两次离心得初提液A；3．热提取液B：水浴提取液A，并使PH为4.5，离心得热提取液B4．乙醇沉淀提取液C：将B冷却并加入乙醇持续搅拌，不少

6、于30min，离心得提取液C1.4结果与分析1.4.1结果表2-1提取液颜色状态体积（ml）A黄色液体17.0B浅黄色液体18.0C淡黄色液体8.27VA总=VA=17.0mlVB总=VB·[VA/(VA-3)]=18.0mlVC总=Vc·[VA/(VA-3)]·[VB/(VB-3)]=Vc·[VB总/(VB-3)]=8.27ml1.4.2分析提取液A、B、C颜色不断便签是因为杂质不断消除。这次的数据与其他小组无太大差距，这不会影响后续实验。1.4.3结论VA总=17.0ml；VB总=218.0ml；VC总=8.27ml。1.5注意事项①第一次离心后取液体时要小

7、心；②水浴时的温度不要超过50℃。同时在保温过程中不断摇动锥形瓶。冰浴时要迅速操作；③冰浴操作过程中慢慢加入缓冲液并搅拌使固体充分溶解，减少损失；1.6认识与体会实验操作无明显错误，操作仍能精确，但需锻炼；离心操作前需平衡，否则会损坏离心机；蔗糖酶在50°C以上失活。2蔗糖酶的纯化——QSepharose-柱层析法2.1实验原理离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以一定pH和离子强度的溶液为流动相，流动相和固定相之间发生可逆的离子交换反应，利用离子交换剂对需要分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。由于各种蛋白质所带电荷的种类和数量不

8、同，它们被吸引的程度也不