酵母蔗糖酶提取方法的研究

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1、酵母蔗糖酶提取方法的研究生命科学学院10级生物科学类李倩10197022指导老师：陶芳摘要：采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，通过抽提、30﹪乙醇分级、50﹪乙醇分级和透析，同时测定各步的蛋白质浓度和酶活，并据此计算比活、回收率和纯化倍数。关键词：蔗糖酶提取自溶法ResearchontheExtractionMethodofYeastSucroseSchoolofLifeSciences，BiologicalSciencesofgrade2,liQian,10197022Abstract:Theautol

2、ysisextractfromyeastinvertase,throughextraction,30ethanolfractionationanddialysis,simultaneousdeterminationofeachstepofconcertrationofproteinandenzymeavtivity,andthencalculatetheradiooflive,recoveryandpurification.Keywords:yeast；extraction；autolysismeth

3、od前言：蔗糖酶（Sucrase,EC3.2.1.26)又称转化酶（Invertase),1928年Dumas等首先指出酵母菌发酵蔗糖时必须有这种酶的存在，蔗糖在蔗糖酶的作用下，水解为葡萄糖和果糖，还原力增加，又由于生成果糖，甜度增加。按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶（β-D-frutofuranosidases,EC3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidases,EC3.2.1.20)。前者存在于酵母中，后者存在于

4、霉菌中。工业上多从酵母中提取。蔗糖酶在工业上用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，还用来制造含果糖和巧克力的软心糖等。本实验目的在于用自溶法提取酵母蔗糖酶的过程中，测定各步的总蛋白、总活力，并据此计算比活、回收率和纯化倍数。1.材料与方法1.1材料与仪器1.1.1材料酵母粉（市售）。1.1.2仪器离心机；722分光光度计；水浴锅等。1.1.3试剂牛血清蛋白；3，5-二硝基水杨酸试剂；考马斯亮蓝G-250；磷酸缓冲液（0.005mol/LpH6.0)等。1.2方法1.2.1蔗

5、糖酶粗品的制备将5g酵母粉倒入500ml烧杯中、少量多次地加入15ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入0.5g乙酸钠、8ml乙酸乙酯，搅匀，再于35℃恒温水浴中搅拌30min。补加10ml蒸馏水后，搅匀盖严，35℃恒温过夜后，4000r/min离心10min,得到的上清液即为粗制酶液。1.2.2葡萄糖标准曲线的制作在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系，可用于比色测定。采用DNS比色法测定还原糖的含量，同时可测定酶活。取葡萄糖标准品，用缓冲液配置成一定梯度浓度的溶液，与DNS显色后在52

6、0nm测定吸光值。表1葡萄糖浓度标准曲线的制作项目空白123456含糖总量mg00.81.21.62.02.42.8葡萄糖液ml00.40.60.81.01.21.4蒸馏水ml2.01.61.41.21.00.80.6DNS试剂ml3333333加热均在沸水浴中加热5min冷却立即用流动冷水冷却蒸馏水ml20202020202020光密度OD520nm以葡萄糖含量（mg)为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，获得的葡萄糖标准曲线回归方程为：y=0.0746x+0.0024。1.2.3蛋白质标准曲线的

7、制定采用考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质浓度。取标准牛血清蛋白，用生理盐水配置一定梯度浓度的系列标准蛋白液，与G-250作用后在595nm测定吸光值。表2蛋白质定量测定标准曲线制作溶液0管1管2管3管4管5管留样1留样1’系列标准蛋白液ml_0.20.40.60.81.00.50.5实际蛋白质含量μg_20406080100__0.9%生理盐水ml1.00.80.60.40.2___蛋白质染色液ml5.05.05.05.05.05.05.05.0轻轻摇匀，5min后以0号管调空白，595nm分光光

8、度法测光密度值，汇出标准曲线。未知样品从标准曲线上查出相应浓度经测定，得表3蛋白质含量与光密度值测定结果试管号012345实际蛋白质含量（mg)_20406080100OD(595)00.1420.3550.4550.6540.787以蛋白质含量（mg)为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。获得的蛋白质曲线方程为：y=7.945x+0.0019。从上述公式可知，吸光值和蛋白质含量呈正相关。1.2.4蛋白质浓度测定从留样中取0.3ml加0.9%的Nacl