《酵母蔗糖酶》PPT课件

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1、实验二、酵母蔗糖酶的提取和酶活测定实验目的学习提取酵母蔗糖酶的方法;测定蔗糖酶活力的方法。实验材料材料:活性干酵母粉、石英砂;试剂:95%冰乙醇、DNS液、PBS(pH7.2)、5%蔗糖溶液、1NNaOH溶液;仪器:水浴锅、离心机、722型分光光度计。实验原理蔗糖酶的提取过程;酶活的测定方法。蔗糖酶蔗糖酶的耐热温度为50度,45度以下可保持酶活不变;在pH3.0~8.0范围内均可保持较高的酶活;蔗糖酶的活性中心有巯基,因此在提取时应防止其被氧化,或者加入还原剂(如Vc)保持酶活力;酵母细胞存在两种蔗糖酶,一种在细胞壁中,一种在细胞质内,前者活力较高,分子量较大(约270KDa),后

2、者活力较低,分子量约为135KDa,两种酶的底物专一性和动力学性质十分相似,因此,本实验未区分内酶与外酶。提取工艺1.破碎酵母细胞的方法:蔗糖酶分子量较大,一般采用研磨法彻底破碎细胞使其释放出来,但应注意研磨过程中保持低温防止酶失活;或者采用自溶法(适当的酸度和温度下利用酵母菌自身的酶系破坏细胞壁),此方法较为温和,但是时间较长,需加入少量防腐剂,防止过程中外界细菌污染;原则:低温,处理时间短,防止酶失活。2.选择性热变性:根据蔗糖酶的耐热性质,将热不稳定性杂蛋白变性除去,而蔗糖酶保持活性仍在上清液中;该法简便易行。原则:1、选择合适的温度和加热时间,防止目的物变性,2、溶液的蛋白

3、质浓度要合适,防止蔗糖酶与杂蛋白共沉淀。3.有机溶剂沉淀法:根据蔗糖酶的分子量和亲水性,在溶液中加入一定量的无水乙醇溶液,利用其脱水作用,破坏了蛋白质分子表面的水化膜,使蔗糖酶聚集沉淀下来,而与其它杂质分开。一般采用分级沉淀法摸索目的物沉淀的条件。原则:1、注意在低温下操作,故无水乙醇要预冷;2、边加乙醇边搅拌溶液,防止局部乙醇过浓,导致酶变性失活;3、离心后应迅速将上清倒出,沉淀物用缓冲液溶解,避免酶与有机溶剂长时间接触,防止其变性。测定酶活的原理1.蔗糖酶可作用于β-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖;Cu2+、Zn2+、Fe2+是其激活剂,Mn2+是其抑制剂。2.

4、葡萄糖和果糖具有还原性,在偏碱性条件下,可与3,5-二硝基水杨酸共热后生成棕红色物质,在一定浓度范围内,还原糖的量和反应液的颜色强度成正比例关系。3.蔗糖酶的活力通过其水解生成的还原糖量来反映。提取酶注意事项了解目的物的分子量、酸碱稳定性、热稳定性,选择合适的提取条件;提取过程中采用缓冲液系统溶解酶,并可添加一些保护剂(如还原剂、金属螯合剂等);提取过程一般保持低温、避免剧烈搅拌、强酸、强碱等变性的因素;一般先选择分辨率低处理量大的方法(如萃取、沉淀、吸附)浓缩酶,再采用分辨率高的方法(如离子交换层析、亲和层析、超滤)精制;通过酶活测定,调节提取条件。实验步骤反复冻融法破碎酵母细胞

5、称取0.5g活性干酵母,0.2g石英砂,置于预冷的研钵中,研磨至粉状,加入10mLPBS(pH7.2),混合均匀,研磨5min,-20度冷冻5~10min,再研磨5min;离心获得粗酶液吸取4mL酵母细胞破碎液于离心管(分装于4只离心管中),8000rpm5min,保留上清液;——粗酶液分离纯化获得纯酶液吸取4mL酵母细胞破碎液于烧杯中,45度水浴10min,缓慢搅拌,迅速冰浴冷却,然后分装于4只离心管中,12000rpm10min,保留上清液;——选择性热变性除去杂蛋白将上清液倒入烧杯,加入等体积预冷的无水乙醇(乙醇终浓度约50%),-20度静置15min,然后分装于4只离心管中

6、,12000rpm10min,保留沉淀物;——有机溶剂沉淀法获得蔗糖酶每只离心管加入0.5mLPBS(pH7.2),轻轻搅拌溶解沉淀物;——纯酶液酶活测定蔗糖酶将蔗糖水解为还原糖试剂(均35度预热)粗酶液组纯酶液组测定组1对照组1测定组2对照组2酶液(mL)1.01.01.01.01NNaOH液(mL)-0.5-0.55%蔗糖液(mL)2.02.02.02.035度水浴10min,自来水冷却1NNaOH液(mL)0.5-0.5-2、DNS法测定还原糖量试剂粗酶液组纯酶液组测定组1对照组1测定组2对照组2水解液(mL)1.01.01.01.0蒸馏水(mL)1.01.01.01.0DN

7、S液(mL)1.01.01.01.0沸水浴5min,自来水冷却,稀释至10mL,以对照组调零,记录测定组OD540nm。实验结果计算酶活力将吸光值代入还原糖标准曲线,得到水解液中还原糖的质量。Y=0.67X+0.027(Y:吸光值;X:还原糖的质量(mg))蔗糖酶活力定义:在一定实验条件下,在规定时间内释放1mg还原糖的酶量为一个活力单位。酶活力(U/mL)=还原糖毫克数×3.5(水解液体积)÷1.0(酶液体积)计算蔗糖酶回收率回收率=纯酶液活力÷粗酶液活力思考题简述

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