《酵母蔗糖酶》PPT课件

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1、实验二、酵母蔗糖酶的提取和酶活测定实验目的学习提取酵母蔗糖酶的方法；测定蔗糖酶活力的方法。实验材料材料：活性干酵母粉、石英砂；试剂：95％冰乙醇、DNS液、PBS（pH7.2）、5％蔗糖溶液、1NNaOH溶液；仪器：水浴锅、离心机、722型分光光度计。实验原理蔗糖酶的提取过程；酶活的测定方法。蔗糖酶蔗糖酶的耐热温度为50度，45度以下可保持酶活不变；在pH3.0~8.0范围内均可保持较高的酶活；蔗糖酶的活性中心有巯基，因此在提取时应防止其被氧化，或者加入还原剂（如Vc）保持酶活力；酵母细胞存在两种蔗糖酶，一种在细胞壁中，一种在细胞质内，前者活力较高，分子量较大（约270KDa），后

2、者活力较低，分子量约为135KDa，两种酶的底物专一性和动力学性质十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶。提取工艺1.破碎酵母细胞的方法：蔗糖酶分子量较大，一般采用研磨法彻底破碎细胞使其释放出来，但应注意研磨过程中保持低温防止酶失活；或者采用自溶法（适当的酸度和温度下利用酵母菌自身的酶系破坏细胞壁），此方法较为温和，但是时间较长，需加入少量防腐剂，防止过程中外界细菌污染；原则：低温，处理时间短，防止酶失活。2.选择性热变性：根据蔗糖酶的耐热性质，将热不稳定性杂蛋白变性除去，而蔗糖酶保持活性仍在上清液中；该法简便易行。原则：1、选择合适的温度和加热时间，防止目的物变性，2、溶液的蛋白

3、质浓度要合适，防止蔗糖酶与杂蛋白共沉淀。3.有机溶剂沉淀法：根据蔗糖酶的分子量和亲水性，在溶液中加入一定量的无水乙醇溶液，利用其脱水作用，破坏了蛋白质分子表面的水化膜，使蔗糖酶聚集沉淀下来，而与其它杂质分开。一般采用分级沉淀法摸索目的物沉淀的条件。原则：1、注意在低温下操作，故无水乙醇要预冷；2、边加乙醇边搅拌溶液，防止局部乙醇过浓，导致酶变性失活；3、离心后应迅速将上清倒出，沉淀物用缓冲液溶解，避免酶与有机溶剂长时间接触，防止其变性。测定酶活的原理1.蔗糖酶可作用于β－1，2糖苷键，将蔗糖水解为D－葡萄糖和D－果糖；Cu2+、Zn2+、Fe2+是其激活剂，Mn2+是其抑制剂。2.

4、葡萄糖和果糖具有还原性，在偏碱性条件下，可与3，5－二硝基水杨酸共热后生成棕红色物质，在一定浓度范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度成正比例关系。3.蔗糖酶的活力通过其水解生成的还原糖量来反映。提取酶注意事项了解目的物的分子量、酸碱稳定性、热稳定性，选择合适的提取条件；提取过程中采用缓冲液系统溶解酶，并可添加一些保护剂（如还原剂、金属螯合剂等）；提取过程一般保持低温、避免剧烈搅拌、强酸、强碱等变性的因素；一般先选择分辨率低处理量大的方法（如萃取、沉淀、吸附）浓缩酶，再采用分辨率高的方法（如离子交换层析、亲和层析、超滤）精制；通过酶活测定，调节提取条件。实验步骤反复冻融法破碎酵母细胞

5、称取0.5g活性干酵母，0.2g石英砂，置于预冷的研钵中，研磨至粉状，加入10mLPBS（pH7.2），混合均匀，研磨5min,－20度冷冻5~10min，再研磨5min；离心获得粗酶液吸取4mL酵母细胞破碎液于离心管（分装于4只离心管中），8000rpm5min，保留上清液；——粗酶液分离纯化获得纯酶液吸取4mL酵母细胞破碎液于烧杯中，45度水浴10min，缓慢搅拌，迅速冰浴冷却，然后分装于4只离心管中，12000rpm10min，保留上清液；——选择性热变性除去杂蛋白将上清液倒入烧杯，加入等体积预冷的无水乙醇（乙醇终浓度约50％），－20度静置15min，然后分装于4只离心管中

6、，12000rpm10min，保留沉淀物；——有机溶剂沉淀法获得蔗糖酶每只离心管加入0.5mLPBS（pH7.2），轻轻搅拌溶解沉淀物；——纯酶液酶活测定蔗糖酶将蔗糖水解为还原糖试剂（均35度预热）粗酶液组纯酶液组测定组1对照组1测定组2对照组2酶液（mL）1.01.01.01.01NNaOH液（mL）－0.5－0.55%蔗糖液（mL）2.02.02.02.035度水浴10min，自来水冷却1NNaOH液（mL）0.5－0.5－2、DNS法测定还原糖量试剂粗酶液组纯酶液组测定组1对照组1测定组2对照组2水解液（mL）1.01.01.01.0蒸馏水（mL）1.01.01.01.0DN

7、S液（mL）1.01.01.01.0沸水浴5min，自来水冷却，稀释至10mL，以对照组调零，记录测定组OD540nm。实验结果计算酶活力将吸光值代入还原糖标准曲线，得到水解液中还原糖的质量。Y=0.67X+0.027（Y：吸光值；X：还原糖的质量（mg））蔗糖酶活力定义：在一定实验条件下，在规定时间内释放1mg还原糖的酶量为一个活力单位。酶活力（U/mL）＝还原糖毫克数×3.5（水解液体积）÷1.0（酶液体积）计算蔗糖酶回收率回收率＝纯酶液活力÷粗酶液活力思考题简述