实验三十八 (9)酵母蔗糖酶的提取.pptx

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1、酵母蔗糖酶的提取实验原理蔗糖酶属于水解酶，催化蔗糖水解为葡萄糖和果糖，本实验选用蔗糖酶含量丰富的酵母为材料提取。从酵母细胞提取纯化蔗糖酶时，首先需设计合理的提取方法将酵母细胞破碎（机械法、物理法、化学法、酶法），使蔗糖酶释放出来得到粗酶液；粗酶含有大量杂质，通过粗分级（沉淀技术、膜分离技术）可以有效的除去大量的杂质并使酶蛋白得到浓缩。在酶的分离提取过程中，酶活性的回收率始终是评估方法优劣的主要指标，在每一步分离提取操作中，都需要对样品的酶活力进行分析，计算出相应的回收率。本实验采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂法测定蔗糖酶活力

2、，蔗糖酶分解无还原性的蔗糖成具有还原性的葡萄糖和果糖，还原糖的量通过DNS法测定，从而计算出酶活力的大小。实验步骤（本实验分4组进行）1、自溶法提取蔗糖酶(1组、2组)称取10g酵母粉于烧杯中，加入30ml0.5mol/L氨水与之混合，再加入3.5ml甲苯，混合均匀，然后用磁力搅拌器在室温下搅拌16-20h完成自溶。测量自溶液体的体积，然后加入1.5倍体积的水，用4mol/L醋酸调pH至5.8，倒入离心管中于8000r/min离心15min，所得上清液称为“粗级分II”，测量其总体积V2，并留下5ml用于蔗糖酶活力测定。由于自溶时

3、间需16-20h，该步骤由上个班的同学完成，可以直接从测量体积步骤开始，实验结束需为下个班的同学准备自溶样品。2、超声破碎法提取蔗糖酶(3组)称取5g酵母粉于小烧杯中，加入30mlpH5.8的醋酸-醋酸钠缓冲液用玻棒搅匀，在600W下处理，每工作3s停3s（120个循环），形成菌体匀浆。此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应在冰浴中进行。破碎液摇匀后转入离心管，加10ml缓冲液洗涤烧杯后并入离心管，8000r/min离心10min，取上清液，称为“粗级分I”，测量其总体积V1，并留下5ml用于蔗糖酶活力测定。3．乙醇分级沉淀初分

4、离粗级分I和II分别通过乙醇分级沉淀进行粗分离。（1）32%乙醇浓度沉淀除杂用4mol/L稀醋酸调粗级分pH至4.5，测量体积V后转入烧杯，按计算所需乙醇体积X1，在磁力搅拌器上用分液漏斗往烧杯中滴加冰乙醇，使乙醇浓度为32%。加完后继续搅拌5min。转移至离心管中8000r/min离心10min。(V为扣除留样的5m后的体积)（2）47.5%乙醇浓度沉淀蔗糖酶取出上清液转入烧杯，按计算使乙醇浓度达到47.5%所需乙醇体积X2，按X2-X1算出需补加无水乙醇的体积。在磁力搅拌器上用分液漏斗往烧杯中缓慢滴加冰乙醇使其浓度达到47.5

5、%。转入离心管中，8000r/min离心10min。弃去上清液，粗级分I和II在此步产生的沉淀分别用10ml和20mlpH5.8的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，得到“粗级分Ⅲ”和“粗级分Ⅳ”，分别测量其总体积V3和V4，并进行蔗糖酶活力测定。4．蔗糖酶活力的测定（1）葡萄糖浓度标准曲线的绘制已绘制，标准曲线如下：Cglu(mgmL-1)=2.253A520+0.053式中y为葡萄糖含量（mgmL-1），x为吸光度A520nm。（2）样品的稀释粗级分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别用pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液稀释相应的倍数(I：2×/III:4×;

6、II:8×/IV:16×)，使得酶活力测定时因酶催化水解而产生的葡萄糖含量以在0.4~1.6mg之间为佳。（3）酶活力测定取5ml5%蔗糖溶液于试管，共加两管，于25℃水浴保温5min，向其中一管加入蔗糖酶溶液1.0ml，立即混匀并计时，准确反应5min后，加入5.0ml0.1mol/LNaOH溶液终止酶反应。另一对照管先加入5.0ml0.1mol/LNaOH溶液，再加入蔗糖酶溶液1.0ml。取比色管3支，第l、2支管分别加入上述反应液各1.0ml及水各1.0ml，第3管加蒸馏水2.0ml，然后各管均加3.0mlDNS试剂。置于沸

7、水浴中5min，取出后用自来水冷却3min，加蒸馏水至25ml，混匀。以第3管调零点，测A520nm。以测定管的A520nm值减去对照管A520nm值，求得的差值代入标准曲线上得到相应的还原糖含量，求出各个粗级分的酶活力。一个蔗糖酶活力单位定义为在上述条件下，每分钟催化底物蔗糖水解产生1mg还原糖所需的酶量。样品酶活力=产生还原糖mg数×11/5×稀释倍数（U/mL）思考题举例说明在细胞破碎和粗分级操作中还有哪些常用方法，分析各方法的优缺点。