实验六酵母蔗糖酶的提取及纯化

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1、实验六酵母蔗糖酶的提取及纯化原理鹿糖酶(invertase)(?—D—呋喃果糖苷果糖水解酶)(fructofuranosidefructohydrolase)(EC.3.2.1.26)特异地催化非还原糖屮的?一呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解lmol蔗糖，就生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson比色法测定还原糖量,由此可得知蔗糖水解的速度。+H20在研宄酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的

2、提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。蔗糖酶0HH0一、蔗糖酶的提取与部分纯化(一)实验目的学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定

3、量的蔗糖酶。（二）实验原理（略）（三）实验仪器、材料及试剂仪器1.高速冷冻离心机、恒温水浴箱、一2（rc冰箱2.电子天平、研钵（〉200ml）、制冰机、50ml烧杯3.离心管（2ml，10ml,30ml或50ml）、移液器（lOOOul）或滴管、量筒材料及试剂1.市售鲜啤洒酵母（低温保存）2.石英砂（海沙）、甲苯（使用前预冷到or以下）3.95%乙醇（预冷一20°C）、去离子水（使用前冷至4°C左右）4.Tris-HCI（pH7.3）缓冲液（四）操作步骤1.提取（1）将市售鲜啤酒酵母2000rpm，离心lOmin,除去大量水分。（2）将

4、研钵稳妥放入冰浴中。（3）称取50g鲜啤酒酵母，加30g石英砂放入研钵中，加50ml预冷的甲苯（边研边加）或预冷的去离子水，在研钵内研磨成糊状，然后每次缓慢加入预冷的10ml去离子水，边加边研磨以便将蔗糖酶充分转入水相。共加75ml去离子水，研磨约40〜60分钟，使其成糊状液体。（注：研磨时可用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞人部分研碎）。(4)将混合物转入50ml(或分装入2个30ml)离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机离心，4°C,15000rpm，15min。观察结果：如果屮间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。(4)用移液器(或滴

5、管)吸出上层有机相(弃棹)。(5)用移液器小心地取出脂肪层下面的水相液转入量筒，量出体积，并记录。(6)取出2ml放入2ml离心管中(标记为粗级分I，一20°C下保存)，用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中。1.热处理(1)将盛有粗级分I的小烧杯迅速地放入50°C恒温水浴屮，保持30分钟，并用玻璃棒温和搅动。(2)取出小烧杯，迅速用冰浴冷却，转入清洁的离心管中(根据量大小选择离心管),4°C,15000rpm,离心15min。(3)将上清液转入量筒，量出体积，并记录。(4)取出2ml放入2ml离心管中(标记为热级分II，

6、一20°C下保存)，用于测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中。2.乙醇沉淀(1)将盛有热处理后的上清液放入小烧杯，在冰浴下逐滴加入预冷的等体积(逐滴加入)95%乙醇，温和搅拌、放置，需1小时。(2)转入清洁的离心管屮，用4°C,15000rpm,离心15min,倾去上清，并滴干。(1)离心管中沉淀用5〜8mlTris-HCI(pH7.3)缓冲液充分溶解(若溶液混浊，则用离心管，4000rpm离心除去不溶物），转入量简，量出体积，并记录。（4）取出2ml放入2ml离心管中（标记为醇级分III,一2（TC下保存），用于测定酶活力

7、及蛋白含量。剩余部分转入清洁的小烧杯中，用于下一步实验。（注：离心管屮沉淀也可盖上盖子或薄膜封门，然后将其放入冰箱中冷冻保存，用时再处理）（五）实验结果与分析记录实验结果，并加以解释，若有异常现象出现，可进行分析讨论。（六）注意事项二、蔗糖酶活性及蛋白质浓度的测定（一）实验目的学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度，用Nelson方法测定酶活力。掌握各步骤的实验原理和方法。（二）实验原理本实验以Nelson方法测定酶活力，其原理是还原糖含有的自由醛基或酮基，在碱性溶液中将Cu2+还原成氧化亚铜，糖本身被氧化成羟酸，砷钼酸试剂与氧化亚铜生成

8、蓝色溶液，在510nm下有正比于还原糖的吸收，从而可确定酶的活力，测定范围：25^200ugo本实验用考马斯亮蓝结合法测定蛋0浓度，考马斯亮蓝能与蛋0质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G2