实验五--DNA片段的体外连接.ppt

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1、实验五DNA片段的体外连接一、实验目的学会DNA的体外连接技术。用T4DNA连接酶将实验四中已回收的目的基因片段与相应的载体DNA片段（用相同的酶切，含匹配的粘性末端）连接起来，构建体外重组DNA分子。二、实验原理体外重组DNA分子是在T4DNA连接酶的作用下、在含Mg2+、ATP等的连接缓冲液系统中，带有匹配末端的两个DNA片段连接而成的。DNA连接酶的作用步骤：①T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-TMP复合物（腺苷酰酶）。②酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切口的DNA片段上，使DNA腺苷化。③产生一个新的磷酸二酯键，并把缺口封起来。通过控制

2、载体DNA与目的DNA的分子比例等来影响重组率。一般情况下，载体DNA的摩尔数与目的基因片段的摩尔数之比为1比5；目的基因片段的比例太大，容易产生基因自连后插入载体的多聚体。连接体积太大自连机会也会增多。（三）连接反应的条件1、缓冲液：一般都配成5~10倍的缓冲液。缓冲液中含有Mg2+、ATP作为辅助因子以为连接反应提供能量，同时也含有一些保护和稳定连接酶活性的物质，如DTT（二硫苏糖醇）可以防止酶氧化失活，BSA（小牛血清白蛋白）可使连接反应中维持有一定浓度的蛋白量，以防止因蛋白浓度太低而使酶变性失活。2、温度：在37℃时有利于连接酶活性的发挥，但在这一温度下结合的粘

3、性末端氢键是不稳定的，而且连接酶的活力也不能保持太久。因此，在实际操作时，折中采用催化反应与末端粘合相一致的温度，即12-16℃左右为宜，也可较温度如4℃下连接，但连接时间要延长。三、实验材料离心机、移液器回收纯化的DNA样品（Rv1791基因）T4DNA连接酶及其附带的缓冲液连接体系：回收DNA片段6ulpCR2.12ul10×连接buffer1ulT4DNA连接酶1ulTotal10ul连接条件：16℃金属浴连接过夜五.思考题DNA的连接方式有哪些?