实验四--五 DNA连接与转化

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1、实验四DNA分子的体外连接实验五DNA连接产物的转化与重组子的筛选在实验室一个重组DNA分子制作过程的基本步骤主要包括6个基本步骤，酶切制备DNA连接转化复制、筛选一.实验目的学习和掌握DNA体外连接的方法与操作步骤。学习和掌握连接产物DNA的转化方法及操作步骤。二.原理ＤＮＡ分子的体外连接ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下，由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸酯键的生物化学过程，ＤＮＡ分子的连接是在PCR反应获得互补序列基础上进行的。质粒必须通过转化，才能进入细菌内进行扩增。转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。用CaCl2处理细菌可以

2、提高细菌吸收周围环境中的DNA分子,这种状态的细菌被称为感受态细菌。冰冷条件下，CaCl2能使细菌细胞膨胀，细胞壁通透性增强，转移到42℃下进行短暂热刺激，待转化的外源DNA便会被细胞所吸收。决定细菌转化效率（频率）的因素有：DNA的浓度、纯度和构型；转化细胞的生长状态；在CaCl2处理和储藏之后的存活率以及转化的环境条件如：温度、pH值、离子浓度等。互补法现在使用的许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸偏码区。这个编码区中插入一个多克隆位点。β—半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZα）β—半乳糖苷酶

3、基因有1021AAs，基因产物装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。lacZ（lacZα）中含有多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表达β—半乳糖苷酶的α-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码α-肽）表达的lacZ基因产物（β链）互补，产生有活性的β—半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下

4、，菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破坏了lacZα-肽基因的结构，细菌内不能产生β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。β—半乳糖苷酶基因的优点:a.酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观b.lacZα编码5‘-端可容许很大的变化（如加入多克隆位点）而不影响酶活性c.lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大PLacZαLacZβ转录翻译αβLacZ基因的结构与产物利用LacZ基因筛选重组子plasmidDNAhostDH5LacZ-N端LacZ-C端-互补-半乳糖苷酶基因三.试剂与器材〈一〉试剂1．LB培养基:在950ml水中加入:bacto-tryptone10gbacto

5、-yeastextract5gNaCl10g用5mol/LNaOH调pH至7.0加水至1L,高压灭菌。2.LB/Amp平板:在950ml水中加入:bacto-tryptone10gbacto-yeastextract5gNaCl10g用5mol/LNaOH调pH至7.0加15g琼脂，加水至1L,高压灭菌，冷却至50℃,加氨苄青霉素至终浓度60μg/ml。IPTG储存液：200mg/ml的双蒸水溶液，用0.22μm的一次性滤器过滤除菌，-20℃保存。X-gal储存液：20mg/ml的二甲基甲酰胺溶液，不必除菌，-20℃保存。0.1mol/LCaCl2感受态细胞〈二〉器材1.37℃温箱、

6、水浴锅、恒温振荡器2.高速冷冻离心机四.操作步骤1、DNA片段的连接根据目的片段和载体大小，以等摩尔比（载体DNA：插入DNA片段=1:3~1:10）计算各自DNA加样量连接体系：组分体积目的片段（GFP基因）6lT载体0.5l10×连接酶buffer1lT4DNA连接酶0.1lddH2O3l→合计10l台式离心机离心10秒以混合均匀，程序为:8℃3’→10℃30’’→12℃30’’→14℃30’’→16℃5’→18℃30’’→4℃1’’(共26个循环)再65℃30’→10℃24h2.感受态细胞的转化(1)在10l连接反应物中取10l（50ng）加于200l感受态

7、细菌，冰浴中放置30分钟，同时设对照：a:标准质粒DNA；b:未连接的DNA产物;c:不加DNA的感受态细胞。(2)42℃热激90秒后，立即放回冰浴中。3-5分钟后补加LB液体（不加抗生素）800l，于37℃振摇45-60分钟。(3)事先将35lX-gal和8lIPTG均匀涂布于一个LB(Amp+)平板上。(4)取100μl或200μl细菌培养液，直接涂布于此含60μg/ml氨苄青霉素的平板上，于37℃培养14-16小时，观察平板上的细菌密度并通过显