边做边学目的DNA片段的体外扩增.ppt

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1、PCR技术及其应用分子生物学技术目录PCR的概念PCR技术的创建PCR的原理PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用聚合酶[多聚酶]链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)Polymerase:DNA聚合酶是一种在体外快速扩增特定基因或DNA（目的DNA片段）的实验技术二.PCR技术的创建KaryB.Mullis（穆里斯（美））1983年,Mullis发明了PCR技术。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸

2、年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。KaryB.Mullis（1944－）（穆里斯（美））生物样品DNA片段基因诊断基因治疗基因工程产品法医学检测人类学研究……PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要应用于细胞内DNA的复制2、时期有丝分裂间期或减数第一次分裂前的间期3、场所细胞核（主）（线粒体、叶绿体）4、模板DNA双链1、概念由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程复习5、原材料：脱氧核苷酸6、基本条件：酶、ATP、原料、模板7、复制过程：①DNA的解旋亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的

3、双链②RNA引物的合成以单股DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物。③DNA的生成以单股的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端→3’端合成DNA。边解旋边复制(过程）8、复制特点半保留复制（结果）9、遵循原则碱基互补配对原则10、精确复制的原因11、复制的意义DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性。①规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板②碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA双链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物总结：细胞内DNA复制的基本

4、体系打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸三.PCR技术的基本原理：在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。1、PCR原理①在80－100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的D

5、NA链又会重新结合成双链。③PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。变性复性延伸加热到94℃，DNA双链解旋为单链降到55℃，引物通过碱基互补配对与单链DNA结合升温到72℃，四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链2、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别体内DNA的复制体外的模拟模板（母链）引物4种脱氧核苷酸DNA聚合酶反应环境DNARNA细胞内源细胞内DNA聚合酶细胞内环境DNA片段DNA/RNA外源加入TaqDNA聚合酶缓冲液①PCR

6、过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸。3、细胞内复制和PCR的主要不同点②PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物　　　　　各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L4、DNA聚合酶特性不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。5、DNA聚合酶作用过程当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的

7、3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。高温解决了打开双链的问题，但又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活，促成了PCR技术的自动化。6、TaqDNA聚合酶的应用7、缓冲液需要为PCR反应提供的物质DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶存在于缓冲液中，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等特性。8、PCR技术的特点四、P

8、CR的反应过程1、PCR的反应步骤PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三