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1、大鼠肝卵圆细胞细胞间黏附分子论文【摘要目的摘要:探索细胞间黏附分子1(ICAM1)在肝卵圆细胞(HOCs)中的表达,及核因子(NFκB)对其表达的调控功能.方法摘要:0.6g/kg3′甲基4二甲基胺偶氮苯（3′methyldimethylaminoazobenzene,DAB）饲喂Wistar大鼠4wk,制作肝损伤模型.利用Percoll密度梯度离心法分离HOCs,免疫细胞化学检测HOCs对ICAM1的表达；体外培养HOCs并分别用NFκB激动剂TNFα和NFκB抑制剂TGFβ1干预,RTPCR对ICAM1mRNA进行半定量分
2、析,比较在TNFα和TGFβ1的调控下ICAM1mRNA表达的变化.结果摘要:HOCsICAM1免疫细胞化学检测明显阳性.和对照组比较,体外培养HOCs时TNFα促进HOCs的增殖(P%26lt;0.01),TGFβ1对HOCs的增殖能力无明显影响；RTPCR半定量分析,和对照组比较，TNFα组ICAM1mRNA相对灰度值增高(P%26lt;0.01),而TGFβ1组ICAM1mRNA相对灰度值降低(P%26lt;0.01).结论摘要:在肝损伤组织中HOCs表达ICAM1,TNFα和TGFβ1分别通过对NFκB活性的促进和抑制
3、来调控ICAM1的表达.【细胞间黏附分子1;肝卵圆细胞；核因子κB0引言近年来,肝卵圆细胞（hepaticstemcells,HOCs）的探究受到重视［1］.在大鼠肝损伤和肝癌模型的肝组织中存在HOCs大量增生［2］,但哪种细胞表达ICAM1还不完全清楚.骨髓造血干细胞（hemopoieticstemcells,HSCs）表面存在一组以ICAM1为主的黏附分子,能介导HSCs和骨髓基质的黏附,从而使HSCs产生一种定向迁移的功能［3］.探究表明,HOCs可以来自于HSCs.既然HOCs可以来自于HSCs,且HSCs表达ICAM
4、1,那么HOCs也应象HSCs一样能表达ICAM1.为此,我们探究HOCs表达ICAM1的证据及其调控.1材料和方法1.1材料5学海无涯Wistar大鼠6只,雌雄不限,体质量(110±10)g,由南方医科大学(原第一军医大学)实验动物中心提供.3′甲基4二甲胺基偶氮苯（3′methyldimethylaminoazobenzene,DAB）购于日本东京化成株式会社；Percoll分离液购自Pharmacia公司；兔抗鼠ICAM1，即用型SABC试剂盒及DAB显色剂购自武汉博士德生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程公司设计合
5、成,βantinsenseprimer5′GCATTGTAACCAACTGGGACG3′,antisenseprimer5′TTGCCGATAGTGATGACCT3′,扩增产物长度为535bp；ICAM1senseprimer,5′CGTGCTGTATGGTCCTCG3′,antisenseprimer5′GGGCTTGTCCCTTGAGTT3′,扩增产物长度422bp；Marker购于上海生工生物工程公司；总RNA提取试剂盒、mRNA逆转录酶、Taq聚合酶购于Promega公司；Ⅳ型胶原酶、TNFα,TGFβ1购于Sigma
6、公司.1.2方法Wistar大鼠正常饲喂1wk后,给予含0.6g/kgDAB饲料饲养,正常饮水,于4wk后大鼠1只,戊巴比妥钠麻醉(25mg/kg,ip),开腹,门静脉切开插管,25mL/min灌注DHanks液至肝表面淡黄除去肝组织里的血液,灌注0.6g/LⅣ型胶原酶至肝组织黄色糜状,将整块肝组织移入烧杯捣碎,于震荡箱37℃恒温震荡消化40min,经100目筛网过滤,未过滤的组织块继续捣碎,加入0.6g/LⅣ型胶原酶继续震荡消化40min,收集过滤液分装于离心管中4℃100g离心10min,取上清液分装于离心管4℃1000g
7、离心30min,弃上清液,用DMEM基础培养液稀释细胞悬液.高速离心管分装Percoll梯度离心液,细胞液铺于上层,4℃12000g离心30min,吸取700mL/L和500mL/L之间细胞液,DMEM基础培养液稀释,4℃1000g离心30min,弃上清液,用150mL/L胎牛血清稀释细胞密度至1.0×109/L.取4个12孔培养板分别标记为A，B，C，D4组,每组又分为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ亚组,每亚组4孔,各孔加入上述细胞悬液0.5mL,然后加适量细胞培养基,Ⅰ亚组为空白对照组,Ⅱ亚组和Ⅲ亚组分别加入2.0×105U/L的TNFα和1
8、0mg/L的TGFβ1.分别于3，6，9，12d计数A，B，C，D组中各1组的细胞数.1.2.1ICAM1免疫细胞化学上述细胞液适量滴于防脱片处理的清洁载玻片上,培养8h后细胞黏附贴壁.具体操作按SABC法试剂盒说明进行.光镜下观察结果.5学海无涯1.2.2ICAM1的RTP
