拟穴青蟹甲壳肽(Crustin)的免疫功能研究.docx

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1、拟穴青蟹甲壳肽（Crustin）的免疫功能研究拟穴青蟹(Scyllaparamamosain),简称青蟹,是我国重要的经济蟹类之一,广泛分布于我国的东海和南海等海域。近年来,伴随着蟹类养殖规模的扩大以及其集约化养殖的发展,各种养殖病害频发严重制约了蟹类养殖产业的发展。青蟹凭借其独特的先天性免疫系统,在外界不良生存环境中有效地抵御外界病原菌的入侵,因而其先天免疫防御机制的研究备受关注。甲壳肽(Crustin)是甲壳动物免疫系统的重要效应分子,本研究我们从青蟹中鉴定了3个甲壳肽基因,分别命名为SpCrus3、SpCrus4和SpCru

2、s5。当前文献报道将甲壳肽分为5类,在I型甲壳肽中,信号肽序列和WAP结构域之间含一个半胱氨酸富含区。通过对获得的SpCrus3和SpCrus4序列进行分析,我们发现这两个分子均属于I型甲壳肽,并且这两个基因的cDNA序列含有相同的5’端。表达模式分析显示:SpCrus3和SpCrus4主要在鳃中表达;在副溶血弧菌或金黄色葡萄球菌刺激后,SpCrus4上调表达,而SpCrus3下调表达。虽然SpCrus3和SpCrus4具有66.06%的相似性,但SpCrus4的抗菌活性强于SpCrus3。微生物结合实验表明SpCrus3和SpC

3、rus4对所有受试微生物均具有结合活性。多糖结合实验表明这两个蛋白对细菌多糖如脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)和肽聚糖(PGN)都具有结合活性,并且SpCrus3和SpCrus4对LPS和LTA的结合活性强于PGN。此外,SpCrus4对LTA的结合活性强于SpCrus3,这可能是这两个蛋白之间抗菌活性呈现显著差异的原因。凝集实验表明SpCrus4对微生物的凝集活性强于SpCrus3,这种增强的凝集活性可能有助于SpCrus4表现出更强的抗菌活性。基于以上结果,我们提出了SpCrus3和SpCrus4参与青蟹抗菌免疫的模型:S

4、pCrus3在健康的青蟹中高度表达以保持低水平的抗菌活性;当细菌感染青蟹时,诱导产生大量的SpCrus4表现出对细菌更强的抗菌活性。根据当前分类标准,II型甲壳肽在N端邻近信号肽区有一段较长的富含甘氨酸的疏水区域(GRR)和一个半胱氨酸富含区,同时在C端含有一个WAP结构域。GRR结构域是区分I型和II型甲壳肽的主要标记基序,并且一些研究表明含有GRR的II型甲壳肽比I型甲壳肽具有更广泛的抗菌谱。我们发现SpCrus5序列的C端含有一个GRR结构域,这与经典的II型甲壳肽的含有N端GRRs结构域不同。表达模式分析显示:SpCrus

5、5主要在鳃中表达;在副溶血弧菌或金黄色葡萄球菌刺激后,SpCrus5上调表达,表明SpCrus5可能参与抗菌免疫反应。为了进一步阐明这种C端GRR结构域是否影响SpCrus5的功能,我们通过删除GRR结构域获得了GRR缺失突变体(SpCrus5-GRR)。SpCrus5成熟蛋白的抗菌活性强于SpCrus5-GRR,前者对革兰氏阴性菌的抗菌谱也广于后者;SpCrus5蛋白对微生物细胞的结合活性和多糖结合活性强于SpCrus5-GRR;SpCrus5和SpCrus5-GRR凝集所有受试的革兰氏阳性菌。上述实验表明,SpCrus5对微生

6、物多糖的结合活性以及对微生物的凝集活性有助于发挥其抗菌活性,并且其C端GRR结构域能够增强SpCrus5的抗菌活性并拓宽其抗菌谱。虽然根据经典分类方法,SpCrus5属于I型甲壳肽,但SpCrus5与大多数II型甲壳肽具有高度相似性并且其功能与一些II型甲壳肽相似,表明SpCrus5更像一个非经典的II型甲壳肽。综上所述,本研究对青蟹中3个甲壳肽基因进行了表达模式及免疫功能研究,发现SpCrus3、SpCrus4和SpCrus5是青蟹免疫体系中的重要抗菌蛋白,它们以不同的方式参与青蟹免疫反应。本研究为了解甲壳肽序列和功能多样性、抗

7、菌机制以及多个甲壳肽如何协作提供免疫保护提供了新的见解。