拟穴青蟹肌质钙结合蛋白的过敏性研究

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1、学校编码１０３９０分类号Ｑ５１２学号２０１５１１７１００２５密级硕士学位论文拟穴青蟹肌质钙结合蛋白的过敏性研究指导教师：刘光明教授作者姓名：胡梦君申请学位级别：硕士学科专业：生物学研究方向：生物化学与分子生物学论文提交日期：２０１８年０４月０９日论文答辩日期：２０１８年０６月０２日学位授予单位：集美大学学位授予日期：２０１８年０６月答辩委员会主席：洪专教授学术诚信声明兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研宄成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含

2、其他个人或集体已经发表或撰写过的研宂成果。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任Ａ声明人（签名）：时间：次以乂．外保护知识产权声明ｇ本人完全了解集美大学有关保留，卩：、使用学位论文的规定学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意集美大学可以用不同方式在不同媒体上发表。、传播学位论文的全部或部分内容作者（签名＞：碣导师（签名：）时间：１／邮，（■外硕士学位论文拟穴青蟹肌质钙结合蛋白的过敏性研究StudyontheAll

3、ergenicityofSarcoplasmicCalcium-bindingProteinfromScyllaparamamosain学科门类：理学作者姓名：胡梦君指导教师：刘光明教授学科专业：生物学研究方向：生物化学与分子生物学学位授予单位：集美大学论文答辩日期：2018年06月02日拟穴青蟹肌质钙结合蛋白的过敏性研究摘要蟹类作为一种营养价值高、肉质鲜美的水产品，广受消费者喜爱，但是随之引起的食物过敏发病率持续上升。本文以拟穴青蟹（Scyllaparamamosain）为研究对象，对青蟹中的新型过敏原肌质钙结合蛋白（sarcoplasmicc

4、alciumbindingprotein，SCP）进行重组表达，对其抗原表位进行定位分析，探讨酶法交联反应、美拉德反应对重组SCP（rSCP）致敏性的影响，以期为过敏性疾病诊断和低致敏性食品开发提供理论依据。本研究首先从拟穴青蟹肌肉中纯化出分子量约20kDa的SCP，通过免疫新西兰大白兔获得兔抗青蟹SCP血清，纯化得到兔抗SCP-IgG多克隆抗体。构建表达载体pET-22b-SCP，在E.coliRossetta菌株中诱导表达获得可溶性的rSCP。圆二色谱、抑制性ELISA、免疫杂交分析结果显示，rSCP与天然SCP（nSCP）均呈典型的α/β蛋

5、白特征，在IgE结合活性方面能够相互抑制，在高温（60℃~100℃）、弱酸（pH2.0~5.0）、强碱（pH10.0~11.0）条件下均易发生聚合，表现出结构、免疫结合能力及理化特性的一致性。体内动物及体外细胞试验结果显示，rSCP使BALB/c小鼠的脾脏淋巴细胞Th2型相关细胞因子IL-4和IL-13分别升高至300pg/mL、250pg/mL，也能够上调蟹类过敏患者嗜碱性粒细胞的表面分子CD63和CD203c水平。不同甲壳类动物的SCP与rSCP可以竞争结合虾蟹类过敏患者血清中IgE，且rSCP的抑制效果最强，提示rSCP可以代替天然蛋白用于

6、过敏原组分诊断。其次，采用嗜碱性粒细胞活化试验确定SCP过敏患者，并用鼠抗人anti-IgE富集SCP过敏患者血清中的IgE；以兔抗SCP-IgG多克隆抗体和SCP过敏患者血清IgE为靶蛋白，经过噬菌体展示技术亲和淘选共定位得到3个IgG抗原表位和6个IgE抗原表位，值得指出的是IgG表位的氨基酸组成均在IgE表位中存在。这些抗原表位主要分布在SCP的一级序列保守区域、二级结构的α-螺旋末端和无规则卷曲柔性区域、蛋白质空间结构的表面；其中Epitope1（N37T38L39I38E41G42R43Y51N54T112）为IgE与IgG所共同识别的

7、抗原表位，在淘选到的克隆子序列中重复性最高，推测为SCP的关键表位。最后，通过分析食品加工处理对rSCP致敏性的影响，发现酪氨酸酶作用下的rSCP酶法交联反应产物（CL-SCP）、木糖与rSCP发生美拉德反应的产物（MR-SCP）致敏性均降低。圆二色谱分析显示，MR-SCP、CL-SCP的α螺旋含量分别降低至16.4%和16.2%，β折叠的含量分别升高至32.2%和31.3%。与rSCP相比，MR-SCP、CL-SCP激活患者嗜碱性粒细胞表达的CD63和CD203c比例下降。结合SCP抗原表位分析认为，酪氨酸酶可以催化交联SCP蛋白表位区域的酪氨

8、酸残基，而美拉德反应可以修饰SCP蛋白的关键抗原表位区域，提示这两种加工方法可以改变过敏原结构与抗原表位，从而降低SCP的致敏性。关键词